L'aptamero anti-VEGF Pegaptanib rivela un meccanismo di legame in due fasi per bloccare l'angiogenesi

Il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) guida l'angiogenesi patologica in malattie tra cui la degenerazione maculare legata all'età di forma neovascolare (nAMD) e vari tumori. Il pegaptanib, uno dei primi biologici anti-VEGF approvati, contiene t44.27 — un aptamero RNA di 27 nucleotidi, pesantemente modificato in posizione 2′, che si lega a VEGF165 con elevata affinità. Nonostante il suo utilizzo clinico, il meccanismo molecolare mediante il quale t44.27 seleziona come bersaglio VEGF e ne antagonizza la funzione era rimasto poco compreso.

Utilizzando la spettroscopia NMR in soluzione come strumento principale, Takeuchi e colleghi hanno caratterizzato sistematicamente il legame di t44.27 al dominio di legame per l'eparina (HBD) di VEGF165. L'HBD è il sito attraverso cui VEGF interagisce con i proteoglicani dell'eparan solfato presenti sulla superficie cellulare e nella matrice extracellulare — interazioni fondamentali per la presentazione del recettore e la segnalazione angiogenica. L'aptamero è estesamente modificato in posizione 2′ (principalmente con sostituzioni 2′-fluoro e 2′-O-metile) per conferirgli resistenza alle nucleasi, e si lega all'HBD di VEGF in modo dipendente dagli ioni Ca2+.

Il risultato centrale è che t44.27 si impegna con l'HBD di VEGF attraverso un processo di riconoscimento in due fasi. Nella prima fase, una regione strutturata dell'aptamero stabilisce un contatto transitorio, a bassa affinità, con l'HBD di VEGF. Nella seconda fase, viene reclutata una superficie di interazione più estesa, formando un complesso stabile e robusto. È stato dimostrato che gli ioni Ca2+ stabilizzano l'appaiamento di basi all'interno di t44.27, necessario per un aggancio iniziale produttivo. In assenza di Ca2+ sufficiente, l'aptamero non riesce ad adottare la conformazione richiesta per la prima fase, compromettendo il legame complessivo. In modo cruciale, è il complesso stretto della seconda fase — e non il contatto iniziale transitorio — a essere responsabile dell'inibizione competitiva del legame dell'eparina all'HBD di VEGF, spiegando così l'attività antagonistica dell'aptamero.

Questi risultati hanno implicazioni rilevanti per la comprensione degli aptameri terapeutici in senso più ampio. Dimostrano che l'inibizione funzionale può richiedere un processo di legame sequenziale, in cui un complesso di incontro iniziale è necessario per fare da stampo alla formazione del complesso ad alta affinità e funzionalmente attivo. Ciò è parallelo ai meccanismi di adattamento indotto e di selezione conformazionale, ben documentati nelle interazioni proteina-proteina e proteina-piccola molecola, ma meno caratterizzati per gli aptameri RNA contro bersagli proteici.

Dal punto di vista della longevità e dell'invecchiamento in salute, l'angiogenesi mediata da VEGF contribuisce non soltanto alla nAMD — una delle principali cause di perdita della vista negli adulti anziani — ma anche alla vascolarizzazione tumorale e potenzialmente alla disfunzione vascolare nei tessuti che invecchiano. Una migliore comprensione meccanicistica di come gli aptameri RNA inibiscano VEGF potrebbe facilitare la progettazione di aptameri migliorati, con cinetiche di legame ottimizzate, ridotta dipendenza dal calcio o maggiore penetrazione tissutale, a potenziale beneficio delle condizioni legate all'invecchiamento al di là dell'occhio.