Gli aptameri del DNA identificano con precisione le cellule senescenti senza una previa conoscenza del bersaglio

La senescenza cellulare — un arresto irreversibile del ciclo cellulare indotto da stress o danno — contribuisce all'invecchiamento e alle malattie correlate all'età attraverso il fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), di natura pro-infiammatoria. Un problema di lunga data nel settore è l'assenza di un singolo biomarcatore universale; i ricercatori devono combinare più indicatori (p16, p21, SA-β-gal, fattori SASP, morfologia) per identificare con certezza le cellule senescenti. Questa lacuna ostacola sia la ricerca di base sia lo sviluppo di senolitici che devono eliminare selettivamente le cellule senescenti senza danneggiare il tessuto sano.

Per affrontare questo problema, il team della Mayo Clinic ha applicato la Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX) — un processo iterativo di selezione in vitro — per sviluppare aptameri di DNA a singolo filamento direttamente contro fibroblasti adulti murini senescenti (MAF). La senescenza è stata indotta con etoposide e rigorosamente validata tramite colorazione SA-β-gal, alterazioni morfologiche, RT-qPCR dei marcatori p16/p21/SASP e perdita di Ki67. Librerie naive contenenti trilioni di DNA casuali a 80 mer sono state sottoposte a nove cicli: gli aptameri sono stati prima depletati contro MAF sani (contro-selezione), quindi selezionati positivamente su MAF senescenti. L'arricchimento della libreria è stato monitorato tramite qPCR e sequenziamento di nuova generazione.

Al settimo ciclo, il recupero è aumentato in modo marcato e si è mantenuto fino al nono ciclo. Il sequenziamento profondo ha confermato la convergenza della libreria a partire dal quinto ciclo. Dieci aptameri candidati sono stati sintetizzati e sottoposti a screening. Tutti e dieci si sono legati ai MAF senescenti in misura maggiore rispetto alle cellule di controllo nel saggio di recupero qPCR; sei hanno mostrato una colorazione preferenziale statisticamente significativa mediante imaging con streptavidina-biotina fluorescente sulla piattaforma IncuCyte. È importante sottolineare che il legame non era un artefatto della coltura prolungata: le cellule di controllo private di siero non hanno acquisito il legame con gli aptameri, ma il trattamento con tripsina delle cellule senescenti ha ridotto drasticamente il legame, implicando come bersaglio una proteina di superficie cellulare o della matrice extracellulare.

Due aptameri — 6757 e 6758 — si sono rivelati in grado di legarsi alla fibronectina, in particolare a una forma presente nelle cellule senescenti, con affinità subnanomolare anche in miscele proteiche complesse. Gli aptameri hanno mostrato un'ampia selettività attraverso molteplici tipi di cellule senescenti (incluse la senescenza indotta da radiazioni e quella indotta da oncogeni) e molteplici linee cellulari murine, suggerendo che l'epitopo della fibronectina da essi riconosciuto sia una caratteristica generale del fenotipo senescente, piuttosto che specifica di un singolo metodo di induzione. Nel tessuto polmonare di topi anziani, un aptamero ha mostrato una colorazione significativamente più elevata rispetto ai controlli giovani; tale colorazione era marcatamente ridotta nei topi transgenici INK-ATTAC nei quali le cellule senescenti esprimenti p16 erano state eliminate farmacogeneticamente, fornendo una convincente validazione in vivo.

Questo studio dimostra che la SELEX cellulare non supervisionata può generare reagenti a DNA specifici per la senescenza senza richiedere una conoscenza preliminare del bersaglio molecolare. Gli aptameri identificati, in particolare quelli che bersagliano la fibronectina, potrebbero essere impiegati come agenti di imaging diagnostico, strumenti per purificare o quantificare le cellule senescenti, oppure come unità di targeting per senolitici coniugati aptamero-farmaco — analoghi ai coniugati anticorpo-farmaco, ma potenzialmente più economici e più facilmente trattabili dal punto di vista chimico.