Un nuovo inibitore di NLRP3 blocca l'infiammazione attraverso una via diversa da quella di MCC950

L'infiammazione è alla base di molte patologie legate all'età, tra cui neurodegenerazione, malattie metaboliche e malattie cardiovascolari. L'inflammasoma NLRP3 ne è un motore centrale: innesca il rilascio di IL-1β e IL-18 e una forma di morte cellulare infiammatoria chiamata piroptosi. Le opzioni attuali sono farmaci biologici che bloccano la segnalazione di IL-1. Gli inibitori di NLRP3 a piccola molecola potrebbero bloccare anche IL-18 e la piroptosi e raggiungere il cervello. La maggior parte dei candidati in fase clinica è costituita da sulfoniluree o derivati di MCC950, che hanno effetti off-target (come l'inibizione dell'anidrasi carbonica 2) e sono poco efficaci contro alcune mutazioni di NLRP3. Per questo gli inibitori chimicamente distinti hanno un grande valore.

Il gruppo di ricerca ha caratterizzato BAL-0028, un indazolo identificato da uno screening di una libreria codificata con DNA di oltre 500 miliardi di composti, insieme a un suo derivato, BAL-0598. I composti sono stati testati in cellule THP-1, monociti e macrofagi umani primari, microglia e macrofagi derivati da iPSC e sangue intero umano. I parametri misurati comprendevano il rilascio di IL-1β e LDH, il clivaggio della caspasi-1 e la formazione di ASC speck. Sono stati inoltre condotti saggi tra specie diverse, saggi ATPasici in vitro e studi di legame (nanoDSF, SPR, DARTS). Infine, BAL-0598 è stato testato in topi con NLRP3 umanizzato.

BAL-0028 ha inibito il rilascio di IL-1β dipendente da NLRP3 con un IC50 di 57,5 nM nelle cellule THP-1 (MCC950: 14,3 nM). È risultato attivo con diversi stimoli (nigericina, ATP, MSU) e in vari tipi cellulari, ed equipotente a MCC950 nella microglia derivata da iPSC. Ha bloccato l'attivazione della caspasi-1, la maturazione di IL-1β e gli ASC speck senza influenzare il priming con LPS, e non è risultato citotossico. Non ha inibito gli inflammasomi AIM2, NAIP/NLRC4 o NLRP1 al di sotto di 10 μM, anche se a 10 μM sono comparsi effetti off-target parziali. La potenza è diminuita di oltre 100 volte nelle cellule di topo ed è risultata assente nelle cellule di ratto, cane e coniglio; è stata invece mantenuta nelle cellule di cercopiteco verde e di macaco cinomolgo e nelle cellule di topo che esprimono NLRP3 umano. Un gruppo di residui nella regione FISNA differisce tra primati e altri mammiferi e potrebbe spiegare questo risultato.

Dal punto di vista meccanicistico, BAL-0028 non ha inibito l'attività ATPasica di NLRP3, a differenza di MCC950. Si è legato al dominio NACHT (KD SPR ~96–113 nM). Nel nanoDSF di competizione ha stabilizzato ulteriormente il NACHT legato a MCC950, e nelle cellule i due composti hanno agito in modo additivo e non sinergico, a sostegno di un sito di legame distinto. BAL-0598 è stato progettato per ridurre il legame alle proteine plasmatiche (circa 98,4% contro 99,9% di frazione legata). Ha mantenuto la stessa selettività di specie, la stessa reversibilità e il legame al NACHT (KD ~193 nM). Ha inibito NLRP3 in vivo in un modello di peritonite in topi umanizzati, ed entrambi i composti hanno inibito alcune mutazioni iperattive di NLRP3 associate a AID in modo più potente di MCC950.

Questi composti rappresentano una nuova modalità di inibizione di NLRP3, potenzialmente utile dove i farmaci di tipo MCC950 falliscono. Tra i limiti: un legame alle proteine plasmatiche molto elevato, la necessità di modelli umanizzati a causa della selettività di specie, l'attività off-target parziale a concentrazioni elevate e l'assenza di dati nell'uomo. L'estratto del testo completo era troncato prima della presentazione dettagliata dei risultati in vivo e sulle mutazioni.