Il farmaco antitumorale GSK461364 blocca l'infiammazione da inflammasoma NLRP3 nei topi
Un composto antitumorale che inibisce PLK1 blocca l'assemblaggio dell'inflammasoma NLRP3 impedendo la fosforilazione di NEK7, attenuando endotossiemia e colite nei topi.
Riepilogo
Gli inflammasomi NLRP3 iperattivi sono alla base di molte malattie infiammatorie, eppure la maggior parte dei farmaci che hanno come bersaglio NLRP3 si è arenata nello sviluppo clinico. I ricercatori hanno analizzato 429 inibitori delle chinasi in macrofagi di topo e hanno individuato GSK461364, un inibitore di PLK1 già sperimentato negli studi oncologici, che bloccava con forza il rilascio di IL-1β dipendente da NLRP3. Non ha influenzato gli inflammasomi AIM2 o NLRC4. Nei topi ha ridotto l'infiammazione nell'endotossiemia indotta da LPS e nella colite indotta da DSS, senza tossicità visibile nell'arco di 9 giorni. Dal punto di vista del meccanismo, PLK1 sembra fosforilare NEK7, probabilmente in corrispondenza di Ser221 e Ser260, rafforzando il legame NEK7-NLRP3 necessario per l'assemblaggio dell'inflammasoma. Il blocco di PLK1 riduce questa fosforilazione e l'attivazione dell'inflammasoma. Il lavoro è preclinico, ma suggerisce la possibilità di riposizionare gli inibitori di PLK1 per l'infiammazione guidata da NLRP3.
Riepilogo Dettagliato
L'inflammasoma NLRP3 è un complesso proteico che innesca l'attivazione della caspasi-1, il rilascio di IL-1β e la morte cellulare piroptotica. La sua iperattivazione è collegata a colite, gotta, aterosclerosi, sepsi e diabete di tipo 2, tutte condizioni rilevanti per l'inflammaging. Molti inibitori diretti di NLRP3, come MCC950, hanno fallito in ambito clinico, quindi servono nuovi bersagli e nuovi farmaci.
Il gruppo di ricerca ha analizzato una libreria di 429 inibitori di chinasi in macrofagi peritoneali murini stimolati con LPS (priming) e poi con nigericina, aggiungendo i composti dopo il priming per evitare effetti sulla fase di priming. Sei composti hanno ridotto IL-1β senza abbassare TNF-α, tra cui quattro con un'attività di soppressione di NLRP3 già riportata, il che ha convalidato lo screening. Il sesto, GSK461364, un inibitore di PLK1, era nuovo. A 10 µM ha bloccato il rilascio di IL-1β, il rilascio di LDH (morte cellulare), il clivaggio della caspasi-1 e l'oligomerizzazione di ASC e la formazione di speck dopo ATP, nigericina o MSU. Ha avuto scarso effetto sugli inflammasomi AIM2 o NLRC4, il che indica selettività per NLRP3.
In vivo, GSK461364 somministrato per via intraperitoneale (10 e 25 mg/kg) ha ridotto l'IL-1β sierica, ma non TNF-α o IL-6, nell'endotossiemia da LPS. Ha inoltre ridotto l'infiammazione polmonare e il clivaggio di GSDMD e della caspasi-1. Nella colite da DSS ha ridotto la perdita di peso, i punteggi di attività della malattia, l'accorciamento del colon, il danno tissutale e l'oligomerizzazione di ASC nel colon. Una dose di 25 mg/kg per 9 giorni non ha prodotto variazioni del peso corporeo, dei marcatori epatici e renali o dell'istologia degli organi, e non è comparsa citotossicità nelle cellule in coltura a 1–20 µM.
Il farmaco non ha alterato il danno mitocondriale, le ROS mitocondriali, l'efflusso di potassio o cloruro, né l'espressione dei componenti dell'inflammasoma. GSK461364 si è legato a PLK1 (KD in SPR circa 5,21 µM), il silenziamento di PLK1 ha mimato i suoi effetti e il farmaco ha perso attività nelle cellule con PLK1 silenziato. PLK1 interagiva con NEK7 ma non con NLRP3. Il knockdown o l'inibizione di PLK1 ha ridotto la fosforilazione di NEK7 su Ser/Thr indotta dalla nigericina e indebolito l'associazione NEK7-NLRP3. Saggi chinasici in vitro (Phos-tag, ADP-Glo) hanno mostrato una fosforilazione diretta di NEK7 da parte di PLK1, ridotta da GSK461364. I mutanti NEK7 S221A e S260A hanno compromesso la produzione di IL-1β in cellule HEK293T ricostituite.
I risultati delineano un asse PLK1/NEK7/NLRP3 e sostengono il riposizionamento degli inibitori di PLK1 per l'infiammazione. Le cautele sono importanti: i dati provengono da modelli murini e cellulari, i siti di fosforilazione sono descritti come "probabili" (individuati tramite mutazioni e predizioni, non confermati con spettrometria di massa) e l'inibizione di PLK1 comporta effetti antimitotici che potrebbero limitarne l'uso cronico. Il lavoro è inoltre in contrasto con altri studi sul ruolo di PLK1 e PLK4 nella regolazione di NLRP3.
Risultati Principali
- Screening 429 kinase inhibitors identified GSK461364, a PLK1 inhibitor, as a selective NLRP3 inflammasome blocker with little effect on AIM2 or NLRC4.
- GSK461364 reduced serum IL-1β, lung inflammation and GSDMD/caspase-1 cleavage in LPS endotoxemia, and eased DSS colitis in mice.
- PLK1 phosphorylates NEK7, likely at Ser221 and Ser260, enhancing NEK7-NLRP3 binding; GSK461364 blocks this phosphorylation.
- The drug lost its effect in PLK1-silenced macrophages, supporting PLK1 as its functional target for NLRP3 inhibition.
- No toxicity was seen in cells (1–20 µM) or in mice given 25 mg/kg over 9 days.
Metodologia
Una libreria di 429 inibitori di chinasi è stata sottoposta a screening mediante ELISA per IL-1β in macrofagi peritoneali murini sensibilizzati con LPS (priming) e stimolati con nigericina. Gli hit sono stati convalidati con molteplici agonisti dell'inflammasoma, saggi di oligomerizzazione di ASC e di formazione degli speck, e con knockdown di PLK1 mediante siRNA. Il coinvolgimento del target (target engagement) è stato dimostrato con CETSA e SPR. La fosforilazione di NEK7 è stata valutata mediante co-IP, Phos-tag, ADP-Glo e mutanti dei siti di fosforilazione; l'efficacia è stata testata in modelli murini di endotossiemia da LPS (n=6) e di colite indotta da DSS.
Limitazioni dello Studio
Tutte le evidenze provengono da modelli murini e cellulari con somministrazione a breve termine, e la valutazione della tossicità ha coperto solo 9 giorni. Ser221/Ser260 come siti di fosforilazione si basano su previsioni e su saggi funzionali con mutanti, anziché su una mappatura diretta dei siti, e i risultati sono in contrasto con i dati che riportano il legame PLK1-NLRP3 e gli effetti di NEK7 mediati da PLK4. Poiché PLK1 è una chinasi mitotica, l'uso antinfiammatorio cronico solleva preoccupazioni su effetti fuori bersaglio e antiproliferativi che non sono state testate, e l'affinità di legame moderata (KD circa 5 µM) lascia spazio a effetti fuori bersaglio.
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