Il blocco della chinasi TTK innesca l'apoptosi mitocondriale nelle cellule di cancro della vescica

Il cancro della vescica è la quarta neoplasia maligna più comune negli uomini, con circa la metà dei casi con invasione muscolare che progredisce nonostante il trattamento entro cinque anni. Questo studio dell'Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong ha indagato perché la TTK protein kinase — una serina/treonina chinasi classicamente associata al controllo del checkpoint di assemblaggio del fuso mitotico — sia così frequentemente sovraespressa nei tumori vescicali e quale vantaggio funzionale tale sovraespressione conferisca alle cellule tumorali.

L'analisi del tessuto vescicale tumorale clinico ha mostrato livelli proteici di TTK significativamente elevati rispetto al tessuto non tumorale adiacente mediante immunoistochimica, e un'elevata espressione di TTK è risultata correlata a una prognosi peggiore per i pazienti. In sei linee cellulari di cancro vescicale (RT-112, UM-UC-3, TCCSUP, T24, 5637, J82), TTK risultava costantemente sovraespressa rispetto alle cellule epiteliali vescicali normali (BdEC). Il silenziamento stabile di TTK mediato da shRNA nelle cellule RT-112 e UM-UC-3 ha ridotto la proliferazione nei saggi CCK-8 e di formazione di colonie, ridotto l'incorporazione di EdU e aumentato marcatamente l'apoptosi alla citometria a flusso con FITC Annexin V/PI — effetti recuperati dalla riesspressione di TTK.

Il dato meccanicistico centrale è che TTK sostiene la mitofagia attraverso due distinti eventi di fosforilazione. In primo luogo, saggi chinasici in vitro con GST-TTK e GST-ULK1 ricombinanti hanno confermato che TTK fosforila direttamente ULK1 in Ser477, attivando l'asse mitofagico ULK1/FUNDC1. Il silenziamento di TTK ha ridotto i livelli di fosfo-ULK1(Ser477) e di FUNDC1, diminuito i puncta GFP-LC3B co-localizzanti con i mitocondri marcati con MitoTracker, ridotto i rapporti di fluorescenza mt-Keima 550/440 nm (indicativi di un minor flusso mitofagolisosomiale acidificato) e diminuito i mitolisosomi mCherry-positivi nel sistema reporter Cox8-EGFP-mCherry. La microscopia elettronica a trasmissione ha confermato un accumulo di mitocondri strutturalmente anomali dopo la perdita di TTK.

In secondo luogo, è stato riscontrato che TTK fosforila il fattore di splicing SRSF3 in Ser108. La spettrometria di massa da immunoprecipitazione (IP-mass spectrometry) nelle cellule RT-112 esprimenti Flag-TTK ha identificato SRSF3 come partner legante. Il sequenziamento dell'RNA delle cellule RT-112 shTTK rispetto a shNC, analizzato con rMATS, ha rivelato che il silenziamento di TTK promuove lo skipping dell'esone 5 di ULK1. Esperimenti di RT-PCR e minigene hanno confermato che SRSF3 riconosce un motivo GCAACGG nell'esone 5 di ULK1; la mutazione di questa sequenza in ACGCCTT ha abolito l'inclusione dell'esone dipendente da SRSF3. La fosforilazione di SRSF3 in Ser108 mediata da TTK ha impedito lo skipping dell'esone 5, mantenendo così l'mRNA di ULK1 a lunghezza intera e stabile. Ciò rappresenta uno strato di regolazione finora non riconosciuto, in cui una chinasi controlla la macchina autofagica non solo attraverso la fosforilazione post-traduzionale di un iniziatore dell'autofagia, ma anche controllando lo splicing del suo pre-mRNA.

Le conseguenze dell'inibizione di TTK hanno convergito sulla disfunzione mitocondriale. La colorazione con MitoSOX Red, la quantificazione LC-MS/MS di MitoP/MitoB del perossido di idrogeno mitocondriale, la colorazione DHE e la citometria a flusso con DCFH-DA hanno mostrato tutte un'elevazione significativa delle ROS mitocondriali e cellulari dopo il silenziamento di TTK. I saggi JC-1 e TMRE hanno dimostrato il collasso del potenziale di membrana mitocondriale. Tali alterazioni hanno attivato i classici marcatori dell'apoptosi intrinseca. In vivo, topi nudi atimici BALB/c portatori di xenotrapianti sottocutanei di RT-112 trattati con l'inibitore selettivo di TTK CFI-402257 (6 mg/kg/giorno per gavage orale a partire dal giorno 14) hanno mostrato volumi e pesi tumorali significativamente ridotti rispetto ai controlli trattati con veicolo, con ricapitolazione della ridotta mitofagia e dell'aumento delle mtROS nel tessuto tumorale prelevato.

Nel complesso, questi risultati stabiliscono TTK come duplice regolatore della mitofagia — che governa sia l'attivazione enzimatica di ULK1 sia l'integrità dell'mRNA di ULK1 — e dimostrano che l'inibizione farmacologica di TTK può spingere le cellule di cancro vescicale oltre una soglia di stress mitocondriale verso l'apoptosi. La disponibilità di inibitori di TTK in fase clinica rende questa una potenziale strategia terapeutica perseguibile.