SPIDR Mappa Decine di Proteine Leganti l'RNA Simultaneamente, Rivelando un Interruttore della Risposta allo Stress

Comprendere come le proteine leganti l'RNA (RBP) regolano l'espressione genica è fondamentale per la biologia cellulare e la medicina, eppure il campo ha finora mancato di metodi capaci di mappare più di una RBP alla volta. SPIDR (split-and-pool identification of RBP targets) colma questa lacuna combinando coniugati anticorpo-oligonucleotide su perline con la reticolazione UV, l'immunoprecipitazione in pool e il barcoding split-pool. Ogni perlina porta un tag di DNA unico che identifica il proprio anticorpo; dopo il pulldown, lo stesso barcode viene ligato sia al tag sia all'RNA co-purificato, consentendo di decodificare tutte le coppie proteina-RNA da una singola corsa di sequenziamento. Il protocollo aggiunge soltanto circa un'ora a un flusso di lavoro CLIP standard e non richiede apparecchiature specializzate.

Applicato alle linee cellulari umane K562 e HEK293T, SPIDR ha profilato simultaneamente più di 50 RBP per esperimento—62 proteine uniche in totale—coprendo fattori di splicing, regolatori della traduzione, enzimi di processamento dell'RNA e componenti di RNA non codificante. Gli esperimenti in replicato hanno mostrato un'elevata riproducibilità (Pearson R mediano = 0,91 nelle regioni ad alta copertura) e un basso livello di contaminazione incrociata tra le popolazioni di perline (>80% dei cluster portava una singola identità anticorpale). Il metodo ha recuperato i siti di legame noti per RBP ben caratterizzate, tra cui PTBP1, HNRNPK, SPEN/SHARP, SLBP, LSM11, LIN28B e proteine ribosomiali, validandone l'accuratezza su diverse classi di RNA.

Una scoperta chiave è stata un'interazione tra LARP1—una proteina collegata al controllo traduzionale dipendente da mTOR—e l'18S rRNA della piccola subunità ribosomiale 40S. La cryo-EM a singola particella ha risolto questo complesso a 2,8 Å, collocando LARP1 nel canale di ingresso dell'mRNA del ribosoma. Questo risultato strutturale fornisce una base meccanicistica plausibile per la nota capacità di LARP1 di sopprimere la traduzione: occupando il canale di ingresso dell'mRNA, LARP1 potrebbe bloccare fisicamente il caricamento del ribosoma sugli mRNA bersaglio.

SPIDR è stato poi utilizzato per esaminare come il legame delle RBP cambia quando mTOR viene inibito con Torin-1, un potente inibitore della chinasi mTOR. In queste condizioni, 4EBP1—un repressore traduzionale normalmente mantenuto inattivo dalla fosforilazione mediata da mTOR—si è associato preferenzialmente agli mRNA legati anche da LARP1. Questo schema di co-occupanza suggerisce che LARP1 e 4EBP1 agiscano in modo cooperativo per imporre una repressione traduzionale selettiva su uno specifico sottoinsieme di mRNA durante lo stress cellulare, anziché causare un blocco generalizzato della sintesi proteica.

La capacità di SPIDR di catturare decine di RBP in un singolo esperimento efficiente in termini di numero di cellule lo rende particolarmente adatto allo studio di cellule primarie, popolazioni cellulari rare e modelli di malattia in cui il materiale è limitato. La sua scalabilità a centinaia di RBP in linea di principio lo posiziona come uno strumento trasformativo per la generazione di mappe complete e specifiche per tipo cellulare delle interazioni RNA-proteina—una risorsa che potrebbe accelerare l'annotazione funzionale delle migliaia di RBP e RNA non codificanti il cui ruolo biologico rimane ancora sconosciuto.