Le piccole molecole da sole possono riprogrammare rapidamente le cellule alla pluripotenza: ecco come

Riprogrammare cellule mature in cellule staminali pluripotenti è una pietra angolare della medicina rigenerativa e della ricerca sul ringiovanimento. La maggior parte dei metodi si basa su fattori di trascrizione veicolati tramite geni. Questo gruppo aveva già sviluppato un sistema di riprogrammazione chimica rapida (fast chemical reprogramming, FCR) che genera cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in 7-12 giorni usando solo piccole molecole, ma la biologia di fondo era poco compresa. Questo studio si chiede in che modo il controllo post-trascrizionale, in particolare lo splicing alternativo (AS), influenzi tale processo.

Gli autori hanno innanzitutto confrontato l'espressione delle proteine che legano l'RNA (RBP) e lo splicing in fibroblasti embrionali di topo (MEF), iPSC indotte chimicamente (fiPSC) e cellule staminali embrionali. I geni dello spliceosoma erano la categoria di RBP più arricchita. I profili di splicing delle fiPSC si raggruppavano con quelli delle cellule staminali embrionali e si distinguevano da quelli dei MEF. Circa 1.000 esoni saltati differivano tra MEF e fiPSC. Gli esoni preferenziali dei MEF erano più corti (mediana 86 vs 104,5 bp) e avevano introni fiancheggianti più lunghi (4.358 vs 3.409 bp). Dunque, le sole piccole molecole hanno rimodellato il panorama dello splicing.

Uno screening con shRNA delle RBP legate allo spliceosoma ha identificato PTBP3 come regolatore negativo. Il suo silenziamento ha circa raddoppiato il numero di colonie di fiPSC senza modificare il numero di cellule. Un secondo shRNA ha riprodotto il risultato, e il recupero con un Ptbp3 resistente allo shRNA lo ha invertito. La sovraespressione ha soppresso le colonie e l'induzione di Oct4 e Dppa5a. Il silenziamento della proteina correlata Ptbp1 ha avuto un effetto minimo. Il silenziamento di Ptbp3 ha favorito anche i fibroblasti polmonari di topo adulto, ma non la riprogrammazione con fattori di trascrizione. L'inibitore del TGF-β 616452 ha indotto Ptbp3, e il silenziamento di Smad2 ha aumentato l'espressione di Ptbp3. Le fiPSC con silenziamento al passaggio 12 esprimevano OCT4, SOX2 e NANOG e formavano tutti e tre i foglietti embrionali.

L'RNA-seq bulk al giorno 8 ha rilevato, dopo il silenziamento, 421 geni codificanti proteine up-regolati e 630 down-regolati; 319 di questi si sovrapponevano a dati pubblicati sul legame di PTBP3. I termini relativi a risposta infiammatoria e attività di NF-kB sono diminuiti. Il piccolo RNA nucleolare Rian, associato al potenziale di sviluppo delle iPSC, è aumentato, mentre il regolatore negativo della riprogrammazione MMVL30-int è diminuito. L'RNA-seq a singola cellula su 21.995 cellule ha mostrato, dopo il silenziamento, più intermedi e iPSC nascenti, vie del lisosoma, dell'autofagia, di mTOR, del proteasoma e di regolazione della longevità up-regolate, e una minore variabilità, con il fattore di Fano in calo in oltre il 95% dei geni.

L'analisi dello splicing ha rilevato modifiche in circa 600 eventi di esone cassetta, 800 di ritenzione intronica, 200 di Alt5 e 200 di Alt3. Gli esoni cassetta vicini ai motivi di legame di PTBP3 coinvolgevano le vie del polycomb, e 93 dei 211 geni con esone cassetta avevano evidenze di legame diretto. Scmh1, un componente di PRC1, ha mostrato uno spostamento nell'equilibrio tra isoforme. Secondo l'abstract, l'asse PTBP3-SCMH1 regola la deposizione di H2AK119ub sui geni infiammatori, e gli inibitori amlexanox e BMS-345541 hanno migliorato ulteriormente l'efficienza dell'FCR.

Le implicazioni sono principalmente meccanicistiche. La riprogrammazione chimica attiva i propri freni, e l'infiammazione e il controllo dello splicing possono essere modulati. Limiti: tutto il lavoro ha utilizzato cellule di topo e shRNA, senza cellule umane né ringiovanimento in vivo. Alcune sezioni successive dell'articolo non erano disponibili per questa sintesi.