I fattori di riprogrammazione spingono le cellule cardiache a rilasciare esosomi che proteggono le cellule vicine dalla morte cellulare
Le modRNA di STEMIN e YAP5SA spingono le cellule cardiache a rilasciare esosomi contenenti microRNA anti-apoptotici, riducendo la morte cellulare sia nelle colture di laboratorio sia nei cuori di topo con infarto.
Riepilogo
Dopo un infarto, i cardiomiociti muoiono per apoptosi e vengono sostituiti da tessuto cicatriziale, che può portare a insufficienza cardiaca. I ricercatori hanno somministrato ai cardiomiociti RNA modificati che codificano STEMIN (un SRF ingegnerizzato) e YAP5SA (uno YAP1 costitutivamente attivo). I due fattori hanno aperto la cromatina in più di 100 geni di microRNA, aumentato i microRNA antiapoptotici come miR-101-3p, miR-499a-5p e let-7c-5p e ridotto l'espressione delle caspasi e di *TP53*. Gli esosomi delle cellule trattate contenevano questi microRNA e hanno ridotto i marcatori di apoptosi nelle cellule umane AC16 sottoposte a stress con staurosporina. In un piccolo esperimento di infarto nel topo (7 animali), una singola iniezione ha ridotto la caspasi-3 clivata di circa il 28% a 48 ore. Il lavoro è preclinico, di piccole dimensioni e non permette di distinguere gli effetti degli esosomi da quelli diretti sulle cellule.
Riepilogo Dettagliato
L'apoptosi dei cardiomiociti è uno dei principali fattori di perdita muscolare dopo un infarto miocardico e nei cuori in insufficienza o invecchiati, e anche un'attivazione di basso livello della caspasi-3 può compromettere la funzione. Poiché il cuore adulto si rigenera poco, sono interessanti le strategie che stimolano la proliferazione e, allo stesso tempo, proteggono le cellule sopravvissute. Questo studio si è chiesto se due fattori di riprogrammazione già noti per indurre il rientro dei cardiomiociti nel ciclo cellulare, STEMIN e YAP5SA, attivino anche un programma antiapoptotico che si diffonde attraverso gli esosomi.
Il gruppo di ricerca ha somministrato modRNA per STEMIN e YAP5SA (confrontati con SRF e YAP1 wild-type) a cardiomiociti di ratto e umani. L'ATAC-seq su cellule di ratto ha mostrato un aumento dell'accessibilità della cromatina in circa 105 loci di miRNA (circa l'85% con STEMIN e il 93% con YAP5SA); 46 di questi miRNA sono predetti come bersaglio di caspasi e geni della famiglia di TP53. L'RNA-seq in cardiomiociti umani adulti primari ha mostrato una downregulation di geni legati all'apoptosi (ad es. TP53, CASP3, CASP6, CASP9, BAK1, BAX) e un'upregulation di miR-101-3p, miR-499a-5p e di membri della famiglia let-7. La qPCR in cellule AC16 ha mostrato una riduzione di CASP3 del 67%, 84% e 98% con STEMIN, YAP5SA e la loro combinazione. I saggi con reporter della luciferasi hanno confermato che let-7c-5p sopprime l'attività della 3′-UTR di TP53 (66%) e RB1 (50%); gli altri effetti miRNA-bersaglio erano tendenze non significative.
Gli esosomi delle cellule AC16 trattate con modRNA avevano le dimensioni attese, contenevano proteine distinte ed erano arricchiti in miRNA tra cui let-7c-5p, miR-21-5p e miR-16-5p, circa il 70% dei quali conteneva motivi noti di sorting esosomiale. Nelle cellule sottoposte a stress con staurosporina, i modRNA di STEMIN o YAP5SA hanno ridotto l'immunofluorescenza della caspasi-3 clivata fino al 92–98%, e i singoli miRNA del 72–98%. La citometria a flusso ha mostrato riduzioni minori (circa 16–37%). Il trasferimento di esosomi ha ridotto la caspasi-3 clivata del 46–80% in modo dose-dipendente, con riduzioni del TUNEL significative solo per gli esosomi di YAP5SA alla dose più alta. Nei topi con legatura coronarica, una singola iniezione di modRNA di STEMIN più YAP5SA ha ridotto la colorazione della caspasi-3 clivata di circa il 28% a 48 ore rispetto al controllo.
Nel loro insieme, i dati supportano un modello in cui questi fattori producono un segnale paracrino pro-sopravvivenza, mediato dagli esosomi, accanto ai loro effetti pro-proliferativi, che potrebbe essere sfruttato per la riparazione cardiaca.
Valgono importanti cautele: lo studio in vivo ha utilizzato solo sette topi, il disegno non consente di distinguere gli effetti degli esosomi da quelli diretti cellulo-autonomi, e il targeting dei miRNA è stato in gran parte predetto anziché dimostrato. Non sono stati misurati la funzione cardiaca, il contributo della proliferazione alla perdita cellulare e gli esiti a lungo termine, e diversi autori hanno interessi commerciali.
Risultati Principali
- STEMIN and YAP5SA opened chromatin at over 100 miRNA loci, with 46 miRNAs predicted to target caspases and TP53-family genes.
- In AC16 cells, combined modRNAs cut CASP3 expression 98% and TP53 94%; let-7c-5p directly suppressed TP53 and RB1 3′-UTR reporters.
- Exosomes from treated cells carried anti-apoptotic miRNAs and reduced staurosporine-induced cleaved caspase-3 by up to 80% in recipient cardiomyocytes.
- A single modRNA injection after coronary ligation in mice lowered cleaved caspase-3 staining about 28% at 48 hours (n=7).
- Flow cytometry showed more modest apoptosis reductions (16–38%) than immunofluorescence, so effect sizes depend heavily on the assay.
Metodologia
Studio preclinico che combina ATAC-seq (cardiomiociti di ratto), RNA-seq/miRNA-seq (cardiomiociti umani primari), tracciamento delle nanoparticelle degli esosomi, proteomica e miRNA-seq, saggi con reporter luciferasi, qPCR, immunofluorescenza, TUNEL e citometria a flusso in cellule AC16 sottoposte a stimolo con staurosporina. La validazione in vivo ha impiegato la legatura coronarica nel topo con iniezione intramiocardica di modRNA e immunoistochimica per la caspasi-3 clivata a 48 ore in 7 animali (3 controlli, 4 trattati).
Limitazioni dello Studio
L'esperimento sul topo era di dimensioni molto ridotte e ha misurato soltanto un marcatore di apoptosi a breve termine, senza valutare la funzione cardiaca, la cicatrice o la sopravvivenza; inoltre non consente di distinguere gli effetti mediati dagli esosomi da quelli cellulo-autonomi. Molte interazioni miRNA–bersaglio sono solo previste o non risultano significative nei saggi reporter, non sono stati condotti esperimenti di inibizione degli esosomi e i risultati dei test variavano tra immunofluorescenza e citometria a flusso. Diversi autori detengono brevetti e interessi commerciali legati alla tecnologia.
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