Il Sequenziamento del DNA su Scala Popolazionale Mappa Come le Mutazioni Somatiche Guidano l'Invecchiamento e il Rischio di Cancro

Le mutazioni somatiche si accumulano nei tessuti normali nel corso della vita, e i cloni che portano mutazioni driver colonizzano progressivamente i tessuti con l'avanzare dell'età. Sebbene questo processo sia centrale nell'iniziazione tumorale e possa contribuire alle malattie correlate all'invecchiamento, studiarlo è stato difficile perché la maggior parte dei cloni è microscopica e i metodi precedenti erano a bassa produttività o limitati a pochi tipi di tessuto.

Questo studio introduce una versione sostanzialmente migliorata di NanoSeq, una tecnologia di sequenziamento duplex che legge entrambi i filamenti di ciascuna molecola di DNA originale per eliminare gli errori di sequenziamento. Due nuovi approcci di frammentazione—la sonicazione con blunting mediante esonucleasi e la frammentazione enzimatica ottimizzata—consentono a NanoSeq di funzionare con pannelli whole-exome e targeted capture mantenendo tassi di errore inferiori a 5 × 10⁻⁹ errori per coppia di basi. Ciò è circa 20 volte inferiore rispetto ai metodi duplex standard e di due ordini di grandezza al di sotto dell'effettivo carico mutazionale delle cellule adulte, rendendo possibile il rilevamento di mutazioni a livello di singola molecola. Il protocollo ha inoltre dimostrato robustezza su DNA danneggiato fissato in formalina, dove il sequenziamento duplex standard risultava inefficace.

Il NanoSeq targeted è stato applicato a 1.042 tamponi non invasivi di epitelio orale e 371 campioni di sangue provenienti da una coorte britannica di gemelli. Nell'epitelio orale, i ricercatori hanno identificato 46 geni sotto selezione positiva, più del doppio di quanto precedentemente riportato per questo tessuto, e hanno rilevato oltre 62.000 singole mutazioni driver. Hanno inoltre trovato prove statisticamente significative di selezione negativa in geni essenziali—un fenomeno raramente osservato negli studi su tessuti somatici. Sono state generate mappe di selezione ad alta risoluzione che coprono regioni codificanti e non codificanti per più geni, realizzando di fatto una saturazione mutagenetica in vivo su scala di popolazione.

Modelli di regressione multivariata sono stati utilizzati per distinguere in che modo i fattori di rischio oncologico noti—età, uso di tabacco e consumo di alcol—alterino indipendentemente i tassi di acquisizione delle mutazioni e il vantaggio selettivo dei cloni driver. L'età è risultata il principale fattore determinante del carico mutazionale nel sangue, con un'accumulo lineare confermato tra i donatori. L'esposizione a tabacco e alcol è stata associata sia a un aumento della mutagenesi sia a un'alterazione della selezione clonale nell'epitelio orale, fornendo un'interpretazione meccanicistica del loro ruolo come cancerogeni.

Il disegno dello studio basato su coorte di gemelli consente inoltre lavori futuri per distinguere i contributi ereditari da quelli ambientali nei paesaggi delle mutazioni somatiche. Complessivamente, questi risultati stabiliscono il NanoSeq targeted come uno strumento scalabile, di livello epidemiologico, per lo studio dell'evoluzione somatica, delle strategie di prevenzione precoce del cancro e del contributo delle mutazioni clonali alla biologia dell'invecchiamento.