Il Popolare Modello Murino di Cellule Senescenti Presenta Difetti Critici in Tutte e Tre le Funzioni di Reporter

La senescenza cellulare — uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare — svolge un duplice ruolo in biologia, sopprimendo i tumori e allo stesso tempo promuovendo l'infiammazione legata all'invecchiamento attraverso il fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). Per comprendere questi ruoli negli organismi viventi sono necessari strumenti in vivo validati. Il topo transgenico p16-3MR, sviluppato dal laboratorio Campisi e pubblicato in un articolo fondamentale su Cell nel 2014, è stato uno degli strumenti più influenti in questo campo, con la pretesa di consentire simultaneamente il rilevamento (tramite Renilla luciferase e mRFP) e l'eliminazione condizionale (tramite HSV-TK/ganciclovir) delle cellule senescenti che esprimono p16INK4a. Questo studio dei gruppi di Hara e Kawamoto dell'Università di Osaka mette ora sistematicamente in luce i problemi fondamentali di quel modello.

Per quanto riguarda il reporter bioluminescente, gli autori hanno scoperto che i segnali precedentemente riportati nei topi p16-3MR rientravano nel rumore di fondo del sistema di imaging IVIS. Quando venivano applicate le soglie di rilevamento appropriate (≥600 conteggi, secondo le linee guida del produttore), non era osservabile alcun segnale al di sopra del background — nemmeno dopo la rasatura del pelo e la correzione per gli artefatti da pigmentazione legati al ciclo del pelo. Fatto cruciale, i topi wild-type iniettati con lo stesso substrato coelenterazina-h producevano segnali equivalenti, dimostrando che le immagini pubblicate in precedenza catturavano l'autofluorescenza del substrato o il segnale di fondo, e non la vera attività della Renilla luciferase. Gli autori hanno mostrato che studi precedenti avevano impostato soglie di rilevamento pari ad appena 10–30 conteggi, rendendo involontariamente il rumore di fondo visivamente indistinguibile dal vero segnale del reporter.

Tre paradigmi sperimentali chiave dell'articolo originale del 2014 sono stati messi alla prova e non è stato possibile riprodurli: (1) l'aumento della bioluminescenza legato all'età nei topi giovani rispetto a quelli anziani, (2) l'induzione del segnale in seguito a trattamento sistemico con doxorubicina (un potente induttore di senescenza) e (3) un picco transitorio di bioluminescenza durante la guarigione cutanea delle ferite. Nessuno di questi fenomeni è stato osservato quando sono stati inclusi adeguati controlli wild-type e applicate le corrette soglie di imaging.

Per quanto riguarda il reporter fluorescente, l'mRFP risultava completamente non rilevabile nei fibroblasti senescenti derivati dai topi p16-3MR, anche in condizioni in cui l'mRNA di p16INK4a era robustamente sovraregolato da molteplici stimoli senescenti (esaurimento replicativo, doxorubicina, attivazione dell'oncogene RAS). Sia l'immunofluorescenza sia la citometria a flusso hanno confermato l'assenza di espressione dell'mRFP. Per quanto concerne il gene suicida, il trattamento con ganciclovir non è riuscito a eliminare selettivamente le cellule senescenti p16INK4a-positive in vitro, nonostante l'induzione della senescenza fosse stata confermata con successo da marcatori indipendenti. I ricercatori hanno invece osservato che il ganciclovir riduceva il numero di macrofagi in vivo indipendentemente dall'espressione di HSV-TK — un effetto off-target che potrebbe mascherarsi come eliminazione di cellule senescenti e spiegare potenzialmente alcuni benefici fenotipici riportati in precedenza.

Gli autori, che erano essi stessi co-autori dell'articolo originale su Cell del 2014 — nel quale utilizzarono dati su topi DKO insieme ai dati sul p16-3MR — sottolineano che i loro risultati non invalidano il concetto biologico secondo cui le cellule senescenti influenzano la guarigione delle ferite o l'invecchiamento. Richiedono tuttavia una rivalutazione critica di tutti i risultati basati esclusivamente sul sistema p16-3MR in assenza di adeguati controlli wild-type. Raccomandano che gli studi futuri che utilizzano questo o modelli simili validino rigorosamente la funzionalità del reporter, includano controlli wild-type iniettati in tutti gli esperimenti di imaging e corroborino i risultati con metodi di rilevamento della senescenza ortogonali.