Il Reidratazione Laser Ripristina la Struttura delle Proteine Dopo la Deposizione Sottovuoto per la CryoEM

La microscopia crioelettronica (cryoEM) ha trasformato la biologia strutturale, ma la preparazione convenzionale dei campioni — tramite blotting e plunge freezing — presenta limiti persistenti. Le proteine trascorrono alcuni secondi all'interfaccia aria-acqua prima della vetrificazione, durante i quali si stima che il 90% si adsorba su tale interfaccia, spesso denaturandosi o assumendo orientamenti preferenziali che compromettono la qualità della ricostruzione 3D. Il soft-landing di spettrometria di massa nativa (MS) su griglie cryoEM è emerso come un'alternativa promettente, poiché aggira completamente l'interfaccia aria-acqua consentendo al contempo la purificazione in fase gassosa di miscele complesse. Tuttavia, rimaneva un ostacolo critico: le proteine depositate nel vuoto perdono acqua, causando una compattazione strutturale misurabile che degrada la risoluzione e distorce la conformazione nativa.

Il team del Wisconsin ha sviluppato il proprio strumento cryo-landing precedentemente descritto integrandovi due nuovi componenti: un erogatore molecolare d'acqua che deposita ghiaccio amorfo a una velocità calibrata di 1,2 nm/s, e un laser a onda continua da 532 nm modulato in impulsi da 15 μs tramite un modulatore acusto-ottico. Dopo che gli ioni di β-galattosidasi furono cryo-landati su griglie UltrAuFoil rivestite di carbonio a una corrente ionica di circa 12 pA per 25 minuti, sulle particelle venne depositato ghiaccio amorfo. Il fascio laser focalizzato (~20 μm FWHM, 15–26 mW sulla griglia) fu quindi fatto scorrere sistematicamente sulla superficie della griglia, liquefacendo brevemente il ghiaccio e consentendo alle molecole d'acqua di reidratare le proteine compattate prima che la massa termica della griglia revitrificasse rapidamente il campione. L'intero trasferimento post-laser in azoto liquido era controllato da computer e completato in meno di un secondo.

Le immagini cryoEM acquisite con un microscopio Glacios a 200 kV hanno rivelato differenze notevoli tra le condizioni. Utilizzando la Fourier shell correlation (FSC) mappa-modello rispetto alla struttura PDB 6CVM a una soglia di 0,5, le particelle cryo-landated e reidratate con laser hanno raggiunto una risoluzione di 8,2 Å rispetto ai soli 20 Å delle particelle cryo-landed non trattate con laser provenienti dalla stessa griglia — un miglioramento di 2,4 volte. Le particelle congelate con plunge freezing convenzionale hanno raggiunto 5,9 Å in condizioni di imaging più favorevoli (ingrandimento 120.000× vs 73.000×, dimensione di pixel inferiore). Per garantire un confronto equo, tutte e tre le ricostruzioni furono calcolate utilizzando lo stesso numero di particelle: 5.684. Le particelle reidratate con laser non hanno mostrato compattazione rilevabile e corrispondevano alla nota struttura quaternaria nativa dell'omotetramero di β-galattosidasi.

Le particelle cryo-landed non trattate con laser, al contrario, mostravano la compattazione precedentemente documentata da Rauschenbach et al. tramite simulazioni di dinamica molecolare — un collasso del guscio di idratazione della proteina e dei contatti terziari sotto vuoto. La fase di reidratazione laser inverte efficacemente questo danno ripristinando transitoriamente un ambiente acquoso attorno a ciascuna particella prima di bloccarla nuovamente nel ghiaccio vetroso. Le medie delle classi 2D e le mappe di distribuzione angolare per il campione reidratato assomigliavano strettamente a quelle delle particelle congelate per plunge freezing, indicando una ritrovata omogeneità conformazionale e un orientamento delle particelle più isotropo.

Le implicazioni vanno ben oltre la β-galattosidasi come sistema modello. Poiché la MS nativa è in grado di separare e selezionare specifiche specie molecolari da miscele eterogenee — inclusi i lisati cellulari — questa pipeline MS-cryoEM accoppiata potrebbe consentire la determinazione strutturale di proteine che non possono essere purificate con metodi biochimici convenzionali. Gli autori riconoscono che la risoluzione attuale (8,2 Å) è ancora inferiore a quella del plunge freezing (5,9 Å), probabilmente a causa del minore ingrandimento utilizzato per le griglie cryo-landed e del dataset di particelle più piccolo, piuttosto che per un limite intrinseco dell'approccio di reidratazione. L'ottimizzazione futura dello spessore del ghiaccio, dei parametri laser e delle condizioni di imaging dovrebbe colmare questo divario.