Scoperto l'enzima chiave TOP3A che controlla il meccanismo di sopravvivenza dei telomeri nei tumori

**Perché è importante:** Almeno il 10–15% di tutti i tumori, in particolare l'osteosarcoma (~45%) e il glioblastoma (~33%), sopravvive senza telomerasi utilizzando ALT — una via di ricombinazione omologa che mantiene i telomeri sufficientemente lunghi per una proliferazione illimitata. A differenza degli inibitori della telomerasi, non esistono attualmente farmaci approvati che prendano di mira ALT, rendendo le scoperte meccanicistiche in questo campo direttamente rilevanti per lo sviluppo di nuove terapie oncologiche.

**Cosa è stato studiato:** Questo studio dell'NCI ha indagato il ruolo della topoisomerasi IIIα (TOP3A), un enzima di tipo IA normalmente coinvolto nel districare il DNA durante la replicazione e nel risolvere le giunzioni di Holliday, a livello dei telomeri ALT. I ricercatori hanno impiegato microscopia a immunofluorescenza, saggi di prossimità per ligazione, RNA FISH, FISH nativa dei telomeri, western blotting, esperimenti di chase con cicloesimide, analisi del ciclo cellulare e strisci cromosomici in metafase in linee cellulari ALT (U2OS, SAOS2, HU09) confrontate con controlli positivi per la telomerasi (SJSA-1, HT1080). Hanno inoltre impiegato il silenziamento di TOP3A mediato da siRNA e la sovraespressione di un mutante autolesivo di TOP3A (R364W) che genera crosslink irreversibili DNA-proteina.

**Risultati principali:** TOP3A ha colocalizzato con la proteina shelterina TERF2 nel 93% delle cellule ALT U2OS, ma era assente dai telomeri nelle cellule positive per la telomerasi. Il silenziamento di TOP3A ha smantellato i corpi nucleari PML associati ad ALT (APB) e ridotto il reclutamento dell'elicasi BLM ai telomeri. Ha anche diminuito drasticamente i segnali di DNA telomerico a singolo filamento C (ssTeloC) — un marcatore distintivo di ALT — e i foci di RNA TERRA ai telomeri, senza ridurre la trascrizione di TERRA, indicando un difetto di reclutamento piuttosto che di espressione. Il western blotting e gli esperimenti di chase con cicloesimide hanno mostrato che la perdita di TOP3A destabilizza selettivamente i componenti shelterina (TERF2, TERF1, POT1) e i membri del complesso BTRR (BLM, RMI1) specificamente nelle cellule ALT. Gli strisci cromosomici hanno rivelato telomeri fragili, sfumati e ultrabrillanti dopo la deplezione di TOP3A. In modo cruciale, l'introduzione del mutante tossico R364W di TOP3A, che forma crosslink DNA-proteina, ha perturbato in modo analogo i foci TERRA e ridotto i livelli di TERF2, suggerendo che intrappolare TOP3A sul DNA sia altrettanto dannoso per i telomeri ALT quanto rimuoverlo del tutto.

**Implicazioni:** TOP3A sembra risolvere intermedi complessi del DNA — giunzioni di Holliday, estensioni del D-loop, superspire ipernegative — generati durante la replicazione indotta da rottura associata ad ALT. Poiché la sua funzione telomerica è specifica per ALT e dispensabile nelle cellule positive per la telomerasi, rappresenta un bersaglio farmacologico promettente con una finestra terapeutica potenzialmente favorevole. Il concetto del mutante autolesivo R364W suggerisce inoltre che piccole molecole capaci di intrappolare TOP3A come complesso di taglio potrebbero uccidere selettivamente i tumori ALT.

**Limiti:** Tutti gli esperimenti sono stati condotti su linee cellulari; è necessaria una validazione in vivo su modelli animali. Il meccanismo molecolare con cui TOP3A stabilizza i livelli proteici della shelterina (sia tramite interazione diretta, protezione dalla degradazione proteasomale o un'altra via) resta da chiarire completamente. Non è inoltre chiaro se il ruolo di TOP3A in ALT si estenda a tutti i sottotipi di tumori ALT al di là delle linee derivate dall'osteosarcoma.