Enzimi Cathepsin Iniettati Eliminano l'Alpha-Sinucleina Tossica e Proteggono i Neuroni nei Modelli di Parkinson

Il morbo di Parkinson (PD) è guidato in gran parte dall'incapacità dei neuroni di eliminare l'alfa-sinucleina (SNCA) aggregata, una proteina che si accumula in corpi di Lewy e neuriti di Lewy e uccide i neuroni dopaminergici nella substantia nigra. La via autofagico-lisosomiale è la principale via di smaltimento della SNCA aggregata e insolubile, e due proteasi cisteiniche lisosomiali — la catepsina B (CTSB) e la catepsina L (CTSL) — sono i principali esecutori di questa degradazione. Molteplici linee di evidenza genetica collegano ora le varianti di CTSB al rischio di PD, e l'attività delle catepsine è misurabilmente ridotta nei neuroni derivati da iPSC portatori di mutazioni di SNCA o di triplicazioni genetiche. Questo circolo vizioso — in cui la SNCA accumulata compromette il macchinario lisosomiale necessario per eliminarla — rende il ripristino dell'attività delle catepsine un bersaglio terapeutico promettente.

Il team della Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg ha prodotto procatepsina B umana ricombinante (rHsCTSB) e procatepsina L umana ricombinante (rHsCTSL) mediante la sovraespressione stabile di costrutti con tag His in cellule HEK293-EBNA, purificando le proforme secrete tramite cromatografia di affinità HisTrap seguita da cromatografia a esclusione dimensionale. Questi enzimi sono stati poi applicati a quattro modelli complementari di patologia da SNCA: linee cellulari neuronali con sovraespressione di SNCA, neuroni dopaminergici derivati da iPSC di pazienti affetti da PD portatori della mutazione puntiforme SNCA A53T, sezioni cerebrali organotipiche e colture neuronali primarie di topi transgenici Thy1-SNCA, e, come prova di principio, iniezioni intracraniche in topi knockout per Ctsd che accumulano aggregati di SNCA endogena a causa dell'assenza dell'attività della catepsina D.

In tutti i modelli, sia rHsCTSB che rHsCTSL sono stati efficientemente endocitati dalle cellule neuronali e trasportati ai lisosomi, dove hanno subito maturazione proteolitica dalle proforme inattive alle forme attive a catena singola e a doppia catena, rilevabili mediante Western blot. Il trattamento ha ridotto significativamente il carico di SNCA in molteplici parametri di valutazione: le frazioni di SNCA insolubili in Triton (che rappresentano le specie aggregate e insolubili), nonché le specie di SNCA rilevate mediante anticorpi specifici per la patologia e specifici per la struttura (incluse le forme fosfo-Ser129 e conformazionalmente alterate), valutate tramite Western blot, immunofluorescenza ed ELISA. Queste riduzioni sono state coerenti in tutti i modelli cellulari e tissutali testati. In modo rilevante, la combinazione di rHsCTSB e rHsCTSL insieme non ha prodotto una riduzione sinergica rispetto a quella ottenuta da ciascun enzima singolarmente, suggerendo specificità sovrapposte per il substrato o vie lisosomiali convergenti piuttosto che meccanismi complementari additivi.

Al di là della diretta eliminazione della SNCA, le catepsine ricombinanti hanno ripristinato l'omeostasi lisosomiale e autofagica più ampia. L'attività della beta-glucocerebrosidasi (GCase) — che è soppressa nel PD e funge da biomarcatore della salute lisosomiale — si è ripresa significativamente dopo il trattamento. I livelli di p62/SQSTM1, un recettore di carico che si accumula quando l'autofagia è compromessa, sono stati normalizzati, confermando il ripristino del flusso autofagico. I difetti sinaptici associati alla SNCA e la tossicità cellulare sono stati anch'essi ridotti nelle colture neuronali trattate. Nel modello murino knockout per Ctsd, le iniezioni intracraniche di entrambi gli enzimi hanno diminuito l'immunoreattività della SNCA nel tessuto cerebrale, fornendo la prima prova di principio in vivo che le catepsine cisteiniche somministrate esogenamente possono penetrare nel tessuto cerebrale e ridurre la patologia da SNCA.

Questo lavoro si basa direttamente sulla precedente dimostrazione dello stesso gruppo che la procatepsina D ricombinante (rHsCTSD) elimina la patologia da SNCA in vivo, e suggerisce che tutte e tre le catepsine lisosomiali — B, L e D — rappresentano bersagli validi per una terapia di tipo sostitutivo enzimatico nelle sinucleinopatie. Le principali limitazioni includono l'uso dell'iniezione intracranica anziché una via di somministrazione sistemica clinicamente applicabile, l'assenza di dati sugli esiti comportamentali negli esperimenti sui topi, e la questione aperta del motivo per cui il trattamento combinato CTSB + CTSL non ha prodotto effetti sinergici. L'efficacia a lungo termine, l'ottimizzazione del dosaggio e le strategie di consegna attraverso la barriera emato-encefalica saranno essenziali prima della traduzione clinica. Ciononostante, i dati convergenti provenienti dai neuroni umani derivati da iPSC, dalle sezioni cerebrali di topo e dai modelli murini in vivo stabiliscono una solida razionale meccanicistica e terapeutica per le strategie di potenziamento delle catepsine nel PD.