La Cryo-ET Rivela Come i Mitocondri Vengono Smantellati e Inglobati nel Percorso del Parkinson

<p>Il morbo di Parkinson è geneticamente collegato a difetti nel controllo della qualità mitocondriale, in particolare attraverso mutazioni in <em>PINK1</em> e <em>PRKN</em> (Parkina). Quando i mitocondri perdono il loro potenziale di membrana, PINK1 si accumula sulla membrana mitocondriale esterna, recluta e attiva la Parkina, e l'organello danneggiato viene infine eliminato mediante mitofagia. Nonostante decenni di lavoro biochimico, le precise modificazioni strutturali alla nanoscala che si verificano durante questo processo all'interno di cellule intatte non erano mai state visualizzate direttamente — fino ad ora.</p>

<p>Il gruppo di ricerca ha ingegnerizzato cellule di osteosarcoma U2OS esprimenti Parkina, co-esprimenti reporter fluorescenti per i mitocondri e la Parkina, quindi le ha trattate con oligomicina e antimicina A (OA) per collassare selettivamente il potenziale di membrana mitocondriale. La microscopia cryo-fluorescente ha guidato il processo di milling cryo-FIB, producendo lamelle di ~200 nm da cellule vetrificate per la cryo-ET. In totale sono stati ricostruiti 92 lamelle e 157 tomogrammi, fornendo un dataset strutturale in situ senza precedenti di mitocondri depolarizzati.</p>

<p>Sono state documentate diverse conseguenze strutturali rilevanti della depolarizzazione. I mitocondri si sono frammentati da un diametro medio di ~1,3 µm a ~0,7 µm. Le creste sono diventate più rade e, in alcuni mitocondri, vescicole delimitate da membrana hanno sostituito il normale interno lamellare. I cluster di fosfato di calcio — normalmente abbondanti nella matrice — erano completamente assenti dopo il trattamento con OA. Una sottopopolazione di complessi F0F1 ATP sintasi, normalmente confinata alle creste, è stata trovata mislocalizzata alla membrana di confine interna (IBM, <em>inner boundary membrane</em>), la regione piatta della membrana interna adiacente alla membrana esterna. Circa il 17% dei frammenti mitocondriali era visibilmente bersagliato da strutture a doppia membrana simili a fagofori, alcune catturate in stadi precoci, intermedi e tardivi (completamente avvolte). In modo cruciale, densità a forma di bastoncino compatibili con ATG2A/BLTP sono state identificate a fare da ponte tra le membrane del fagoforo e le membrane donatrici adiacenti, fornendo evidenza diretta in cellula del trasferimento lipidico durante l'espansione del fagoforo.</p>

<p>Il ritrovamento strutturale forse più originale ha riguardato il complesso delle proibitine, un'impalcatura dodecamerica (sei dimeri PHB1-PHB2) residente nello spazio intermembrana (IMS) sulla membrana mitocondriale interna. La media dei sottotomogrammi ha risolto il complesso sia in cellule non trattate che in cellule trattate con OA con una risoluzione sufficiente a distinguere due stati conformazionali — una forma aperta e divaricata e una chiusa a cupola compatta. Il trattamento con OA ha significativamente arricchito la conformazione chiusa, suggerendo che le proibitine subiscano un cambio conformazionale funzionalmente rilevante in risposta allo stress mitocondriale, un risultato con potenziali implicazioni per la comprensione di come l'architettura delle creste e l'organizzazione proteica siano regolate durante la mitofagia.</p>

<p>Questi dati stabiliscono complessivamente una linea di base strutturale alla nanoscala per la mitofagia mediata da PINK1-Parkina nelle cellule umane. Dimostrano la potenza della cryo-CLEM correlativa e della cryo-ET nel catturare in situ eventi transitori di rimodellamento mitocondriale e forniscono un quadro di riferimento per futuri studi che dissecano il preciso macchinario molecolare dell'autofagia selettiva nel contesto della neurodegenerazione.</p>