La cryo-EM Rivela Come i Canali Kir4.1/5.1 Bloccano il Flusso di Potassio

I canali del potassio a rettificazione interna (Kir) regolano il potenziale di membrana e l'omeostasi del potassio nel cuore, nel cervello, nei reni e nell'orecchio interno. Tra questi, il canale eteromerico Kir4.1/5.1—formato dai prodotti genici di KCNJ10 e KCNJ16—riveste un'importanza particolare: le mutazioni di KCNJ10 causano la sindrome EAST/SeSAME (epilessia, atassia, ipoacusia neurosensoriale, tubulopatia renale), e l'inibizione farmacologica di Kir4.1/5.1 produce effetti diuretici e antidepressivi nei modelli animali. Nonostante decenni di studi elettrofisiologici e di mutagenesi, il meccanismo a livello atomico con cui le poliammine come la spermina bloccano questi canali producendo la rettificazione interna era rimasto irrisolto.

Il gruppo di ricerca ha espresso costrutti troncati ma funzionalmente validati di Kir4.1 (residui 25–368) e Kir5.1 (residui 20–355), ne ha confermato le proprietà elettrofisiologiche corrispondenti ai canali a lunghezza intera e li ha purificati in micelle di detergente glico-diosgenina (GDN) in assenza di PIP2. Mediante cryo-EM a singola particella, il team ha determinato quattro strutture: il canale apo e i complessi con spermina, VU0134992 ed EHop-016, tutti a una risoluzione compresa tra 3,1 e 3,5 Å. Il canale si assembla come un eterotetramero 2:2 in un'disposizione alternata (opposta)—non nella sequenza 4-5-4-5 precedentemente ipotizzata—con dimensioni di circa 115 × 65 × 70 Å, un dominio transmembrana conservato e un dominio citoplasmatico ricco di foglietti beta.

Il risultato più significativo è il meccanismo di blocco denominato "inner-ring blockage". Anziché disporsi linearmente lungo l'asse del poro come in precedenza ipotizzato, la spermina (due molecole), VU0134992 (due molecole) ed EHop-016 (una molecola) adottano tutte un orientamento parallelo alla membrana nel sito superiore della cavità centrale transmembrana. Formano così una barriera ad anello che occluda il flusso ionico. Il residuo acido chiave E158 di Kir4.1 (il "controllore della rettificazione") coordina questi ligandi, spiegando perché la mutazione di questo residuo abolisce la rettificazione forte. I dati strutturali sono corroborati dall'elettrofisiologia e da simulazioni di dinamica molecolare, che confermano come l'occupazione del bloccante in questo sito impedisca la corrente K+ uscente.

EHop-016, precedentemente noto solo come inibitore della Rac GTPasi con proprietà antitumorali, è stato qui identificato per la prima volta come potente inibitore dei canali Kir, con valori di IC50 pari a 0,80 ± 0,05 μM per Kir4.1 e 3,20 ± 0,18 μM per Kir4.1/5.1. La sua occupazione a singola molecola nel sito inner-ring contrasta con il legame a due molecole della spermina e di VU0134992, illustrando come la geometria molecolare determini la stechiometria del blocco. Le due distinte interfacce delle subunità citoplasmatiche (Kir4/5 canonica e Kir5/4 atipica) presentano anch'esse differenze strutturali e sono probabilmente alla base della peculiare sensibilità al pH dell'eteromero e della sua rettificazione più intensa rispetto all'omomerico Kir4.1.

Queste strutture definiscono un quadro unificato per la comprensione della farmacologia dei canali Kir e forniscono un modello per la progettazione razionale di farmaci diretti contro Kir4.1/5.1 nelle malattie neurologiche, cardiovascolari e renali.