L'editing delle basi negli embrioni umani silenzia PCSK9 con un'efficienza quasi perfetta
Alcuni scienziati della Columbia hanno ottenuto il 100% di editing allelico di *PCSK9* in embrioni umani utilizzando i base editor, aprendo la strada a una riduzione ereditabile dei livelli di LDL, ma restano ostacoli sul piano della sicurezza.
Riepilogo
Le rotture del DNA indotte da Cas9 negli embrioni umani possono causare grandi delezioni e un numero anomalo di cromosomi. I ricercatori hanno testato gli editor di basi dell'adenina (adenine base editor) che hanno come bersaglio PCSK9 e HBG1/2. La proteina ABE8e(V106W), somministrata al momento della fecondazione, ha modificato tutti i 32 alleli di PCSK9 esaminati in cinque embrioni. La somministrazione della proteina ha permesso lo sviluppo fino allo stadio di blastocisti e, dopo l'editing di basi, non sono state osservate inserzioni né delezioni, piccole o grandi. Tuttavia, si sono verificate rare rotture cromosomiche nel sito bersaglio, anomalie cromosomiche ed editing involontario a mosaico. ABE8.8-m, somministrato come mRNA, ha causato frequenti arresti precoci dello sviluppo embrionale. Gli autori concludono che le lesioni causate dagli editor di basi vengono riparate in modo efficiente, ma i rischi genomici e di sviluppo che permangono precludono, allo stato attuale, l'uso clinico in ambito riproduttivo.
Riepilogo Dettagliato
Le rotture a doppio filamento del DNA indotte da Cas9 vengono riparate in modo scadente negli embrioni umani e possono causare grandi delezioni e anomalie cromosomiche. Gli editor di basi dell'adenina, invece, introducono interruzioni a singolo filamento (nick) e modifiche di singole basi. Questo studio ha esaminato gli esiti della riparazione e lo sviluppo precoce dopo l'editing di PCSK9 e dei promotori di HBG1/2 in embrioni umani. PCSK9 è stato bersagliato con una modifica pensata per interromperne la funzione; la modifica di HBG1/2 corrisponde a una variante associata alla persistenza dell'espressione dell'emoglobina fetale in età adulta.
I ricercatori hanno somministrato ABE8.8-m come mRNA, oppure ABEmax e ABE8e(V106W) come complessi proteina–RNA guida. Le iniezioni sono state eseguite in zigoti a due pronuclei o in ovociti in metafase II al momento della fecondazione. L'editing è stato valutato mediante sequenziamento Sanger, con l'aggiunta del sequenziamento di nuova generazione per l'analisi di HBG.
La proteina ABEmax somministrata allo stadio a due pronuclei ha prodotto modifiche omozigoti di PCSK9 in 47 blastomeri su 77 (61%); l'mRNA di ABE8.8-m ha prodotto modifiche omozigoti in 42 cellule su 64 (66%). La proteina ABE8e(V106W) somministrata alla fecondazione ha modificato tutti i 32 alleli bersaglio esaminati in cellule e pronuclei di cinque embrioni. L'abstract riporta inoltre la derivazione di linee di cellule staminali omozigoti modificate.
Il formato di somministrazione ha influenzato lo sviluppo. Su 44 embrioni iniettati con mRNA di ABE8.8-m, 38 (86%) si sono arrestati allo stadio da una a quattro cellule e due hanno raggiunto lo stadio di blastocisti. Un editor inattivo ha migliorato in modo significativo lo sviluppo rispetto all'editor attivo (P=0,0081, test di Kruskal–Wallis). L'arresto si è verificato anche in assenza di RNA guida, suggerendo un'attività della deaminasi indipendente dalla guida. Con i complessi proteina–guida di ABEmax o ABE8e(V106W), lo sviluppo fino a blastocisti è stato simile a quello dei controlli e non è stato osservato alcun arresto precoce in nessuno dei due stadi di iniezione.
Dopo l'editing di basi non sono state osservate inserzioni né delezioni, piccole o grandi. Tuttavia si sono verificate, in modo raro, rotture cromosomiche nel sito bersaglio e anomalie cromosomiche, e l'editing bystander e off-target è risultato a mosaico. Pertanto, il successo dell'editing del bersaglio e lo sviluppo fino a blastocisti non hanno dimostrato la sicurezza genomica.
Gli autori concludono che le lesioni indotte dagli editor di basi vengono riparate in modo efficiente rispetto alle rotture del DNA indotte da Cas9, ma gli effetti avversi genomici e dello sviluppo ne precludono attualmente l'uso clinico in ambito riproduttivo. Si tratta di risultati ottenuti su embrioni in laboratorio, non di prove di una gravidanza sicura, di una prole sana o di prevenzione clinica di malattie.
Risultati Principali
- ABE8e(V106W) protein delivered at fertilization edited all 32 PCSK9 target alleles examined in cells and pronuclei from 5 human embryos
- ABE8.8-m mRNA arrested 38 of 44 embryos (86%) at the one-to-four-cell stage; 2 reached blastocysts, and an inactive editor improved development (P=0.0081)
- No insertions or small or large deletions were observed after base editing, but rare on-target chromosome breakages and chromosomal abnormalities occurred
- ABEmax and ABE8e(V106W) protein–guide complexes supported blastocyst development similar to controls, with no early arrest observed at either injection stage
- The researchers derived homozygous edited stem cell lines, as reported in the abstract
- Bystander and off-target editing was mosaic, leaving genomic risks despite efficient intended editing
- Arrest also occurred when ABE8.8-m mRNA was delivered without guide RNA, implicating guide-independent deaminase activity
Metodologia
Zigoti umani a due pronuclei e ovociti in metafase II, al momento della fertilizzazione, sono stati trattati con editor di basi dell'adenina (adenine base editor) mirati a PCSK9 e/o HBG1/2. ABE8.8-m è stato somministrato come mRNA; ABEmax e ABE8e(V106W) sono stati somministrati come complessi proteina–RNA guida. Il testo fornito descrive il sequenziamento Sanger di blastomeri e pronuclei, il sequenziamento di nuova generazione (next-generation sequencing) per l'analisi di HBG, il follow-up dello sviluppo fino al sesto giorno e i controlli con iniezione fittizia (mock) e con editor inattivi. Il confronto tra mRNA attivo e inattivo ha utilizzato il test di Kruskal–Wallis. L'abstract riporta inoltre la derivazione di linee di cellule staminali omozigoti modificate.
Limitazioni dello Studio
Il risultato completo di editing di *PCSK9* si basava su 32 alleli esaminati in cinque embrioni e non va generalizzato a tutti gli embrioni o a tutti i protocolli di editing. Lo sviluppo fino allo stadio di blastocisti non dimostra la sicurezza dello sviluppo successivo né quella riproduttiva. Sono rimaste anomalie cromosomiche rare, nonché editing bystander e off-target di tipo mosaico. Gli esperimenti di arresto associati all'mRNA hanno chiamato in causa un'attività deaminasica indipendente dalla guida. L'estratto fornito si interrompe a metà frase e non sostiene i dettagli aggiuntivi sui saggi, i risultati quantitativi sugli effetti off-target né i limiti del confronto tra metodi di somministrazione inclusi nel riassunto originale.
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