Il Base Editing Corregge Mutazioni Cardiache Fatali nei Topi e nelle Cellule Staminali Umane

Le laminopatie sono una famiglia di malattie genetiche causate da mutazioni nel gene LMNA, che codifica le proteine strutturali dell'involucro nucleare Lamina A e C. Sono state identificate oltre 400 varianti, per lo più mutazioni puntiformi missense, che producono uno spettro di fenotipi devastanti tra cui cardiomiopatia dilatativa, difetti di conduzione e distrofia muscolare. Non esistono attualmente terapie curative e la gestione clinica è limitata al controllo dei sintomi.

Questo studio ha preso di mira due specifiche mutazioni puntiformi di LMNA: R249Q (c.G746>A), associata a cardiomiopatia dilatativa con difetti di conduzione (DCM-CD), e L35P (c.T104>C), correlata alla distrofia muscolare congenita (CMD). Cellule mononucleate del sangue periferico di pazienti sono state riprogrammate in iPSC e differenziate in cardiomiociti (iPSC-CMs). Gli iPSC-CMs con la variante R249Q hanno mostrato aberrazioni nucleari, aumento dei marcatori di danno al DNA e transitori del calcio anomali. Gli iPSC-CMs con la variante L35P hanno evidenziato contrazione anomala, danno al DNA elevato e ridotta espressione proteica di Lamina A/C, confermando che entrambe le varianti compromettono la biologia fondamentale dei cardiomiociti.

Per modellare la malattia in vivo, il gruppo di ricerca ha generato topi knock-in "umanizzati" portatori delle mutazioni patogene umane tramite riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR. I topi R249Q omozigoti hanno sviluppato aritmie cardiache, difetti di conduzione e morte prematura. I topi L35P omozigoti hanno manifestato grave atrofia muscolare e aspettativa di vita ridotta, mentre i topi L35P eterozigoti hanno sviluppato DCM, riproducendo con elevata fedeltà lo spettro della malattia umana.

Per la correzione terapeutica, i ricercatori hanno progettato una strategia basata su un editor di basi adeniniche (ABE8e) per R249Q e un approccio basato su un editor di basi citosiniche (CBE/SpRY) per L35P, ciascuno abbinato a sgRNA ottimizzati. Negli iPSC-CMs, la correzione precisa ha completamente ripristinato la morfologia nucleare, il danno al DNA, la gestione del calcio e la funzione contrattile. Per la somministrazione in vivo, costrutti AAV9 a split-intein che codificano le metà N- e C-terminali degli editor di basi sono stati iniettati per via intraperitoneale in topi neonati (giorno postnatale 4) alla dose di 3×10¹⁴ vg/kg. L'editing di basi mediato da AAV ha prevenuto i difetti di conduzione cardiaca e le aritmie nei topi R249Q e ha ridotto la distrofia muscolare e la disfunzione cardiaca nei topi L35P, con una misurabile estensione dell'aspettativa di vita in entrambi i modelli.

Questi risultati sono significativi perché dimostrano che entrambe le piattaforme ABE e CBE possono ottenere una correzione terapeuticamente rilevante di distinte mutazioni di LMNA in modelli clinicamente pertinenti, senza introdurre rotture del DNA a doppio filamento. Il lavoro stabilisce un quadro di prova di concetto per la terapia di editing di basi di precisione nelle laminopatie e potenzialmente in altre cardiomiopatie genetiche, sebbene la traduzione clinica richiederà l'ottimizzazione dell'efficienza di editing nel tessuto cardiaco adulto e una rigorosa valutazione della sicurezza rispetto ai bersagli non intenzionali.