I neutrofili invecchiati secernono CCL3 per alimentare la crescita tumorale in diversi tipi di cancro

I neutrofili sono tra le cellule immunitarie più abbondanti nei tumori, eppure la loro diversità funzionale è stata difficile da studiare su larga scala, poiché il loro basso contenuto di RNA li fa scartare dai filtri di qualità standard del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo punto cieco tecnico ha lasciato aperte importanti domande su quali stati dei neutrofili siano realmente pro-tumorigenici e se alcuni di essi siano conservati tra i diversi tipi di cancro.

Per risolvere questo problema, Bolli e colleghi hanno sviluppato un classificatore probabilistico del tipo cellulare basato su regressione logistica, addestrato su un dataset inDrop che cattura i neutrofili in modo efficiente. Applicato prima di qualsiasi filtraggio del conteggio genico, il classificatore ha recuperato da 23 a 67 volte più neutrofili rispetto alle soglie convenzionali nelle coorti di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC) e carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). L'accuratezza è stata validata attraverso la concordanza con l'immunoistochimica CD66b, la marcatura con anticorpi in citometria a flusso e dataset di sequenziamento arricchiti in neutrofili. Il classificatore ha inoltre generato un predittore dell'abbondanza di neutrofili a partire da dati bulk RNA-seq, che ha superato le prestazioni di una firma di riferimento ampiamente utilizzata ed è rimasto una variabile prognostica indipendente nella regressione di Cox multivariata su 8.305 pazienti TCGA — con una forza comparabile al consolidato score di polarità macrofagica CXCL9/SPP1.

L'applicazione del classificatore a oltre 190 campioni tumorali umani e murini ha rivelato una traiettoria di differenziazione dei TAN conservata, che si conclude in uno stato terminale ad alta espressione di CCL3. Questi TAN CCL3-hi erano arricchiti per programmi trascrizionali associati all'adattamento ipossico, alla senescenza e all'attività pro-tumorale. Le analisi spaziali e citofluorimetriche hanno confermato che i TAN CCL3-hi occupano preferenzialmente nicchie ipossiche all'interno dei tumori in entrambe le specie. Lo stato CCL3-hi si allineava con le caratteristiche precedentemente descritte dei neutrofili "invecchiati", tra cui la sovraregolazione di CXCR4 e la sottoregolazione di CD62L.

Per stabilire la causalità, il gruppo ha impiegato due strategie genetiche complementari nel modello murino: il knockout specifico dei neutrofili per CCL3 mediato da CRISPR/Cas9 e la modellizzazione gain/loss-of-function basata su ER-Hoxb8. La delezione di CCL3 specifica per i neutrofili ha ridotto l'accumulo di TAN specificamente nelle regioni tumorali ipossiche e ha compromesso la crescita tumorale senza determinare una deplezione generalizzata dei neutrofili. Dal punto di vista meccanicistico, CCL3 segnalava attraverso CCR1 sugli stessi TAN, sostenendo segnali di sopravvivenza autocrini/paracrini nel microambiente ipossico ostile.

Questi risultati ridefiniscono CCL3 non semplicemente come una chemochina infiammatoria, ma come un driver funzionale conservato dei neutrofili invecchiati e pro-tumorali. Il framework scalabile del classificatore qui presentato apre la strada alla profilazione sistematica dei neutrofili sull'intera gamma degli attuali dataset scRNA-seq oncologici, e la segnalazione CCL3–CCR1 emerge come un asse terapeutico perseguibile.