Bloqueio da Quinase TTK Desencadeia Apoptose Mitocondrial em Células de Câncer de Bexiga

O câncer de bexiga é a quarta neoplasia maligna mais comum em homens, com aproximadamente metade dos casos músculo-invasivos progredindo apesar do tratamento em cinco anos. Este estudo da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong investigou por que a proteína quinase TTK — uma serina/treonina quinase classicamente associada ao controle do ponto de verificação do fuso mitótico — é tão frequentemente superexpressa em tumores de bexiga e qual vantagem funcional essa superexpressão confere às células cancerosas.

A análise de tecido clínico de câncer de bexiga mostrou níveis proteicos de TTK significativamente elevados em comparação com o tecido não tumoral adjacente por imuno-histoquímica, e a alta expressão de TTK correlacionou-se com pior prognóstico dos pacientes. Em seis linhagens de células de câncer de bexiga (RT-112, UM-UC-3, TCCSUP, T24, 5637, J82), a TTK foi consistentemente superregulada em relação a células epiteliais normais da bexiga (BdEC). O knockdown estável de TTK mediado por shRNA em células RT-112 e UM-UC-3 reduziu a proliferação nos ensaios CCK-8 e de formação de colônias, reduziu a incorporação de EdU e aumentou acentuadamente a apoptose por citometria de fluxo com FITC Annexin V/PI — efeitos revertidos pela reexpressão de TTK.

A principal descoberta mecanicista é que a TTK sustenta a mitofagia por meio de dois eventos de fosforilação distintos. Primeiro, ensaios de quinase in vitro utilizando GST-TTK e GST-ULK1 recombinantes confirmaram que a TTK fosforila diretamente a ULK1 em Ser477, ativando o eixo de mitofagia ULK1/FUNDC1. O knockdown de TTK reduziu os níveis de fosfo-ULK1(Ser477) e FUNDC1, diminuiu os puncta de GFP-LC3B co-localizados com mitocôndrias marcadas com MitoTracker, reduziu as razões de fluorescência 550/440 nm de mt-Keima (indicando menor fluxo mitofagolisossomal acidificado) e diminuiu as mitolisossomas positivas para mCherry no sistema repórter Cox8-EGFP-mCherry. A microscopia eletrônica de transmissão confirmou o acúmulo de mitocôndrias estruturalmente anormais após a perda de TTK.

Em segundo lugar, verificou-se que a TTK fosforila o fator de splicing SRSF3 em Ser108. A espectrometria de massa por imunoprecipitação de células RT-112 expressando Flag-TTK identificou SRSF3 como parceiro de ligação. O sequenciamento de RNA de células RT-112 shTTK versus shNC, analisado com rMATS, revelou que o knockdown de TTK promoveu o skipping do éxon 5 de ULK1. Experimentos de RT-PCR e minigene confirmaram que SRSF3 reconhece um motivo GCAACGG no éxon 5 de ULK1; a mutação dessa sequência para ACGCCTT aboliu a inclusão do éxon dependente de SRSF3. A fosforilação de SRSF3 em Ser108 mediada por TTK impediu o skipping do éxon 5, mantendo assim o mRNA de ULK1 estável e de comprimento completo. Isso representa uma camada de regulação anteriormente não reconhecida, na qual uma quinase controla a maquinaria de autofagia não apenas pela fosforilação pós-traducional de um iniciador de autofagia, mas também controlando o splicing de seu pré-mRNA.

As consequências da inibição de TTK convergiram para a disfunção mitocondrial. A coloração com MitoSOX Red, a quantificação por LC-MS/MS de MitoP/MitoB do peróxido de hidrogênio mitocondrial, a coloração com DHE e a citometria de fluxo com DCFH-DA mostraram elevação significativa das espécies reativas de oxigênio (ROS) mitocondriais e celulares após o knockdown de TTK. Os ensaios com JC-1 e TMRE demonstraram colapso do potencial de membrana mitocondrial. Essas alterações ativaram marcadores clássicos de apoptose intrínseca. In vivo, camundongos nude BALB/c atímicos portadores de xenoenxertos subcutâneos de RT-112 tratados com o inibidor seletivo de TTK CFI-402257 (6 mg/kg/dia por gavagem oral a partir do dia 14) apresentaram volumes e pesos tumorais significativamente reduzidos em comparação com os controles tratados com veículo, com recapitulação da mitofagia reduzida e elevação de mtROS no tecido tumoral coletado.

No geral, esses achados estabelecem a TTK como um regulador duplo da mitofagia — governando tanto a ativação enzimática de ULK1 quanto a integridade do mRNA de ULK1 — e demonstram que a inibição farmacológica de TTK pode levar as células de câncer de bexiga além de um limiar de estresse mitocondrial para a apoptose. A disponibilidade de inibidores de TTK em estágio clínico torna essa uma estratégia terapêutica potencialmente aplicável.