SPIDR kartiert Dutzende RNA-bindende Proteine gleichzeitig und enthüllt einen Stressantwort-Schalter

Das Verständnis der Regulation der Genexpression durch RNA-bindende Proteine (RBPs) ist von zentraler Bedeutung für die Zellbiologie und Medizin, doch fehlten bislang Methoden, um mehr als ein RBP gleichzeitig zu kartieren. SPIDR (split-and-pool identification of RBP targets) schließt diese Lücke durch die Kombination von antikörperbeschichteten Kügelchen-Oligonukleotid-Konjugaten mit UV-Quervernetzung, gepoolter Immunpräzipitation und Split-Pool-Barcoding. Jedes Kügelchen trägt einen einzigartigen DNA-Tag, der seinen Antikörper identifiziert; nach dem Pulldown wird derselbe Barcode sowohl an den Tag als auch an die ko-aufgereinigte RNA ligiert, sodass alle Protein-RNA-Paare aus einem einzigen Sequenzierungslauf dekodiert werden können. Das Protokoll fügt einem Standard-CLIP-Workflow lediglich etwa eine Stunde hinzu und erfordert keine speziellen Geräte.

Angewandt auf humane K562- und HEK293T-Zelllinien, erstellte SPIDR gleichzeitig Profile von mehr als 50 RBPs pro Experiment – insgesamt 62 einzigartige Proteine – und umfasste Spleißfaktoren, Translationsregulatoren, RNA-prozessierende Enzyme und Komponenten nicht-kodierender RNAs. Replikatexperimente zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit (medianer Pearson-R = 0,91 in Regionen mit hoher Abdeckung) und ein geringes Übersprechen zwischen den Kügelchenpopulationen (>80 % der Cluster trugen eine einzige Antikörperidentität). Die Methode erfasste etablierte Bindungsstellen für gut charakterisierte RBPs, darunter PTBP1, HNRNPK, SPEN/SHARP, SLBP, LSM11, LIN28B und ribosomale Proteine, was ihre Genauigkeit über verschiedene RNA-Klassen hinweg validiert.

Eine wichtige Entdeckung war eine Wechselwirkung zwischen LARP1 – einem Protein, das mit der mTOR-abhängigen Translationskontrolle in Verbindung gebracht wird – und der 18S-rRNA der kleinen ribosomalen 40S-Untereinheit. Einzelpartikel-Kryo-EM löste diesen Komplex bei 2,8 Å auf und positionierte LARP1 am mRNA-Eingangskanal des Ribosoms. Dieser strukturelle Befund liefert eine plausible mechanistische Grundlage für die bekannte Fähigkeit von LARP1, die Translation zu unterdrücken: Indem LARP1 den mRNA-Eingangskanal besetzt, könnte es die ribosomale Beladung der Ziel-mRNAs physisch blockieren.

SPIDR wurde anschließend eingesetzt, um zu untersuchen, wie sich die RBP-Bindung verändert, wenn mTOR mit Torin-1, einem potenten mTOR-Kinase-Inhibitor, gehemmt wird. Unter diesen Bedingungen assoziierte 4EBP1 – ein Translationsrepressor, der normalerweise durch mTOR-vermittelte Phosphorylierung inaktiv gehalten wird – bevorzugt mit mRNAs, die auch von LARP1 gebunden wurden. Dieses Muster der gemeinsamen Besetzung legt nahe, dass LARP1 und 4EBP1 kooperativ zusammenwirken, um eine selektive Translationsrepression einer spezifischen Teilmenge von mRNAs während zellulärem Stress aufzuzwingen, anstatt eine pauschale Abschaltung der Proteinsynthese zu bewirken.

Die Fähigkeit von SPIDR, Dutzende von RBPs in einem einzigen, zellzahleffizienten Experiment zu erfassen, macht es besonders geeignet für die Untersuchung von Primärzellen, seltenen Zellpopulationen und Krankheitsmodellen, bei denen das Material begrenzt ist. Die prinzipielle Skalierbarkeit auf Hunderte von RBPs positioniert es als ein transformatives Werkzeug zur Erstellung umfassender, zelltypspezifischer RNA-Protein-Interaktionskarten – eine Ressource, die die funktionelle Annotation der Tausenden von RBPs und nicht-kodierenden RNAs, deren biologische Rollen noch unbekannt sind, beschleunigen könnte.