Moléculas pequenas, sozinhas, podem reprogramar células rapidamente para a pluripotência — veja como
Cientistas descobrem como o splicing de RNA e a modificação de histonas interagem para turbinar a reprogramação química, abrindo novas portas para a medicina regenerativa.
Resumo
Pesquisadores agora conseguem transformar células comuns do tipo pele de camundongo em células-tronco usando apenas um coquetel de pequenas moléculas, em cerca de 7 a 12 dias. Como isso funciona ainda não está claro. Este estudo analisou o splicing de RNA, o processo que permite que um único gene produza várias versões de uma proteína. A equipe descobriu que um regulador de splicing chamado PTBP3 atua como um freio na reprogramação. Reduzir sua expressão praticamente dobrou o número de colônias de células-tronco. O PTBP3 altera a forma como outro gene, o SCMH1, sofre splicing. O SCMH1 ajuda a colocar uma marca de silenciamento gênico, a ubiquitinação de H2AK119, em genes inflamatórios. Diminuir a sinalização inflamatória favoreceu a reprogramação, e os medicamentos amlexanox e BMS-345541 melhoraram ainda mais a eficiência. O trabalho foi feito em células de camundongo, mas aponta caminhos para tornar o rejuvenescimento e a regeneração celular mais seguros e eficientes.
Resumo Detalhado
Transformar células maduras de volta em células-tronco pluripotentes é um pilar da medicina regenerativa e da pesquisa de rejuvenescimento. A maioria dos métodos depende de fatores de transcrição entregues por genes. Esta equipe havia desenvolvido anteriormente um sistema de reprogramação química rápida (FCR) que gera células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em 7 a 12 dias usando apenas moléculas pequenas, mas a biologia subjacente era pouco compreendida. Este estudo investiga como o controle pós-transcricional, especificamente o splicing alternativo (AS), influencia esse processo.
Os autores primeiro compararam a expressão de proteínas de ligação ao RNA (RBPs) e o splicing em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), iPSCs induzidas quimicamente (fiPSCs) e células-tronco embrionárias. Os genes do spliceossomo foram a categoria de RBPs mais enriquecida. Os perfis de splicing das fiPSCs agruparam-se com os das células-tronco embrionárias e se afastaram dos MEFs. Cerca de 1.000 éxons ignorados (skipped exons) diferiram entre MEFs e fiPSCs. Os éxons preferenciais dos MEFs eram mais curtos (mediana de 86 vs 104,5 pb) e tinham íntrons flanqueadores mais longos (4.358 vs 3.409 pb). Assim, apenas com moléculas pequenas, o panorama de splicing foi remodelado.
Uma triagem com shRNA de RBPs relacionadas ao spliceossomo identificou PTBP3 como um regulador negativo. Seu silenciamento (knockdown) praticamente dobrou o número de colônias de fiPSCs sem alterar o número de células. Um segundo shRNA reproduziu esse resultado, e o resgate com um Ptbp3 resistente ao shRNA o reverteu. A superexpressão suprimiu as colônias e a indução de Oct4 e Dppa5a. O knockdown do Ptbp1, relacionado, teve efeito mínimo. O knockdown de Ptbp3 também ajudou fibroblastos de pulmão de camundongos adultos, mas não a reprogramação por fatores de transcrição. O inibidor de TGF-β 616452 induziu Ptbp3, e o knockdown de Smad2 aumentou a expressão de Ptbp3. As fiPSCs com knockdown no passagem 12 expressaram OCT4, SOX2 e NANOG e formaram as três camadas germinativas.
O RNA-seq em massa no dia 8 encontrou 421 genes codificadores de proteínas com aumento de expressão e 630 com redução após o knockdown, e 319 deles se sobrepuseram a dados publicados de ligação do PTBP3. Os termos de resposta inflamatória e atividade de NF-kB diminuíram. O RNA nucleolar pequeno Rian, associado ao potencial de desenvolvimento das iPSCs, aumentou, e o regulador negativo da reprogramação MMVL30-int diminuiu. O RNA-seq de célula única de 21.995 células mostrou mais intermediários e iPSCs nascentes após o knockdown, vias de lisossomo, autofagia, mTOR, proteassomo e regulação da longevidade com aumento de expressão, e menor variabilidade, com o fator de Fano diminuindo em mais de 95% dos genes.
A análise de splicing encontrou alterações em cerca de 600 eventos de éxon cassete, 800 de retenção de íntron, 200 de Alt5 e 200 de Alt3. Os éxons cassete próximos a motivos de ligação do PTBP3 implicaram vias polycomb, e 93 de 211 genes com éxon cassete tinham evidência de ligação direta. O Scmh1, um componente do PRC1, teve seu equilíbrio de isoformas alterado. Segundo o resumo do artigo, o eixo PTBP3-SCMH1 regula a deposição de H2AK119ub em genes inflamatórios, e os inibidores amlexanox e BMS-345541 melhoraram ainda mais a eficiência da FCR.
As implicações são principalmente mecanísticas. A reprogramação química ativa seus próprios freios, e a inflamação e o controle do splicing podem ser ajustados. Ressalvas: todo o trabalho usou células de camundongo e shRNA, sem células humanas nem rejuvenescimento in vivo. Algumas seções posteriores do artigo não estavam disponíveis para este resumo.
Principais Descobertas
- Ptbp3 knockdown increased fiPSC colony numbers about 2-fold without changing overall cell numbers, and a second shRNA and rescue experiments confirmed the effect
- About 1,000 skipped exons differed between MEFs and fiPSCs, and fiPSC splicing profiles clustered with embryonic stem cells rather than MEFs
- Deep RNA-seq after Ptbp3 knockdown found 421 upregulated and 630 downregulated genes, 319 of which overlapped published PTBP3 binding data
- Single-cell RNA-seq of 21,995 cells showed more intermediates and nascent iPSCs after knockdown, with the Fano factor falling in over 95% of genes
- Ptbp3 knockdown shifted about 600 cassette-exon and 800 intron-retention events, and 93 of 211 cassette-exon genes showed direct PTBP3 binding, including the PRC1 component Scmh1
- Removing the TGF-β inhibitor 616452 from the cocktail sharply cut Ptbp3 expression, and Smad2 knockdown raised Ptbp3
- The anti-inflammatory compounds amlexanox and BMS-345541 further improved reprogramming efficiency (per the abstract)
Metodologia
O estudo utilizou fibroblastos embrionários de camundongo e fibroblastos de pulmão de camundongo em um protocolo de reprogramação química com 12 pequenas moléculas, comparando fiPSCs com células-tronco embrionárias. Os métodos incluíram uma triagem com shRNA avaliada pela formação de colônias, experimentos de resgate e de superexpressão, qPCR, RNA-seq em bulk no dia 8, scRNA-seq 10x no dia 12 (21.995 células), análise de splicing com vast-tools e perfil de H2AK119ub ao longo da reprogramação. Os dados de colônias vieram de três experimentos independentes combinados (n = 3 cada), analisados com testes t não pareados de Welch, enquanto o RNA-seq das amostras com knockdown utilizou n = 2 experimentos independentes e o scRNA-seq utilizou testes de soma de postos de Wilcoxon.
Limitações do Estudo
Todos os experimentos usaram células de camundongo em cultura e dependeram de knockdown por shRNA, portanto a relevância para humanos, os efeitos in vivo e a segurança a longo prazo não foram testados. Os efeitos foram específicos da reprogramação química e mínimos na reprogramação por fatores de transcrição, e algumas comparações de RNA-seq usaram apenas duas réplicas. O texto completo foi truncado para esta análise, portanto as limitações declaradas pelos autores e quaisquer declarações de conflito de interesses não estavam disponíveis.
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