Vesículas Musculares Neonatais Carregadas com miR-542-3p Revertem o Envelhecimento do Músculo Esquelético em Camundongos

Sarcopenia — a perda progressiva de massa e força muscular esquelética com o envelhecimento — é uma das marcas mais impactantes do envelhecimento humano, impulsionando fragilidade, quedas e perda de independência. As intervenções atuais (treinamento de resistência, suplementação de proteínas, agentes farmacológicos) apresentam limitações individuais, motivando a busca por terapias biológicas livres de células. Este estudo apresenta vesículas extracelulares derivadas de músculo neonatal (NMEVs) como uma fonte anteriormente inexplorada de sinais rejuvenescedores, entregues por meio de um inovador sistema de patch de microagulhas (MN).

As vesículas extracelulares foram isoladas dos músculos gastrocnêmios de camundongos neonatos com 2 dias de vida (NMEVs) e de camundongos adultos com 3 meses de idade (AMEVs) por ultracentrifugação diferencial a 120.000g por 2 horas, seguida de análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão para caracterização. Ambas as preparações confirmaram marcadores canônicos de EV (TSG101, CD9, CD81-positivos; Calnexin-negativos), com NMEVs apresentando diâmetro médio de aproximadamente 100–150 nm. Em mioblastos C2C12 senescentes induzidos por ácido palmítico (PA, 200 µM), NMEVs a 100 µg/mL superaram significativamente as AMEVs em todos os desfechos medidos: as NMEVs reduziram a atividade da SA-β-galactosidase, diminuíram os níveis proteicos de p21 e p16, restauraram o potencial de membrana mitocondrial, reduziram as espécies reativas de oxigênio, melhoraram o número de cópias do DNA mitocondrial e reduziram o acúmulo de gotículas lipídicas, enquanto as AMEVs produziram apenas melhorias modestas na mesma dose.

Para superar a barreira de entrega — EVs livres são rapidamente eliminadas antes de atingir o tecido muscular profundo —, a equipe desenvolveu um patch de microagulhas (MN) de dupla camada denominado NMEVs@PLGA@Fucoidan-HA MN. As NMEVs foram primeiramente encapsuladas em microesferas de PLGA (diâmetro médio ~2–5 µm), que foram então incorporadas em uma camada de ponta de hidrogel de fucoidana-ácido hialurônico (HA), com uma camada de suporte de polivinilpirrolidona (PVP) proporcionando rigidez mecânica. O revestimento de fucoidana foi selecionado por suas propriedades anti-inflamatórias e afinidade de direcionamento ao CD44 via HA. O conjunto de microagulhas penetrou a pele a ~600 µm, dissolveu-se em aproximadamente 5 minutos em contato com o fluido intersticial e liberou microesferas de PLGA que proporcionaram entrega sustentada de NMEVs por vários dias. Imagens de fluorescência confirmaram a penetração da ponta das agulhas no tecido dérmico e a internalização de EVs marcadas com PKH67 em células C2C12 em 24 horas.

Em camundongos idosos de 20 meses tratados por quatro semanas com o patch MN aplicado no membro posterior sobre o gastrocnêmio, NMEVs@PLGA@Fucoidan-HA MN aumentou significativamente a área de secção transversal (CSA) das fibras musculares, melhorou a força de preensão, reduziu a área de fibrose positiva para tricrômico de Masson, diminuiu os depósitos lipídicos corados com Oil Red O e reduziu a expressão dos marcadores de senescência p21/p16 em comparação tanto com controles idosos não tratados quanto com um grupo de injeção de NMEVs livres. A função mitocondrial melhorou, medida pelo aumento da produção de ATP, elevação do potencial de membrana mitocondrial (ensaio JC-1), maior número de cópias de mtDNA e restauração da expressão das subunidades do complexo de fosforilação oxidativa.

Mecanisticamente, o sequenciamento de miRNA revelou que o miR-542-3p estava entre os miRNAs mais enriquecidos nas NMEVs em comparação com as AMEVs. Ensaios repórter de luciferase confirmaram a ligação direta ao 3′-UTR do miR-542-3p tanto ao Eef1a1 (fator de elongação de tradução eucariótica 1 alfa 1) quanto ao Asxl2 (additional sex combs-like 2). O silenciamento de Eef1a1 ativou a via de sinalização AMPK (aumento de fosfo-AMPK, fosfo-ACC), melhorando a biogênese mitocondrial e reduzindo os marcadores de senescência. Independentemente, o silenciamento de Asxl2 reduziu os níveis da proteína PPARγ, suprimindo assim a formação de gotículas lipídicas em mioblastos sob estresse com PA. Experimentos de resgate por superexpressão confirmaram que a restauração de Eef1a1 ou Asxl2 atenuou os efeitos protetores da transfecção com o mimético de miR-542-3p, validando o mecanismo de duplo alvo. Um inibidor de miR-542-3p atenuou os efeitos antienvelhecimento das NMEVs in vitro, confirmando sua centralidade.

Este estudo é pré-clínico e conduzido exclusivamente em camundongos, portanto, a tradução para a terapia da sarcopenia humana requer validação adicional. A via de entrega por MN é inovadora para aplicações de direcionamento muscular e mostra potencial para acesso transdérmico a músculos superficiais; no entanto, a profundidade de penetração para grupos musculares mais profundos em humanos seria um desafio de engenharia significativo. O estudo fornece prova de conceito de que uma preparação de EV derivada de tecido neonatal, enriquecida em um miRNA funcionalmente potente e entregue por meio de uma plataforma de biomaterial desenvolvida para este fim, pode simultaneamente abordar disfunção mitocondrial, senescência celular, fibrose e desregulação lipídica no músculo esquelético envelhecido.