Flavonoide Natural Neoeriocitrina Potencializa a Regeneração Óssea por Células-Tronco via Autofagia

A regeneração de defeitos ósseos continua sendo um grande desafio clínico, e as estratégias atuais que dependem de fatores de crescimento como o BMP-2 acarretam riscos graves, incluindo ossificação ectópica e tumorigênese, além de alto custo e instabilidade. As células-tronco da polpa dental humana (hDPSCs), derivadas de dentes descartados com baixa imunogenicidade e forte potencial osteogênico, oferecem uma fonte celular alternativa promissora — mas requerem agentes osteindutores eficazes e seguros para ativar seu fenótipo de formação óssea.

Este estudo investigou a neoeriocitrina (Neo), um flavonoide natural encontrado em frutas cítricas e em Drynaria fortunei, como novo agente osteoindutor para hDPSCs. In vitro, o tratamento com Neo aumentou de forma dose-dependente a proliferação das hDPSCs em concentrações não tóxicas e regulou positivamente de maneira significativa a expressão de marcadores osteogênicos, incluindo Runx2, Colágeno I, fosfatase alcalina (ALP) e osteopontina (OPN), além de aumentar a mineralização de cálcio, medida pela coloração com Vermelho de Alizarina no dia 21.

Para identificar o alvo molecular direto da Neo, os pesquisadores empregaram o perfil proteômico térmico (TPP) — um método de identificação de alvos farmacológicos não tendencioso em escala proteômica, que combina o ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA) com espectrometria de massa quantitativa por marcação em tandem (TMT). Entre as proteínas com maior estabilização térmica, a Beclin1, reguladora mestre da iniciação da autofagia, emergiu como o principal alvo de ligação direta. Esse achado foi validado por experimentos independentes de CETSA, ancoragem molecular (utilizando PDB: 6HOJ e AutoDock) e simulações de dinâmica molecular (GROMACS), que confirmaram interações estáveis de ligação Neo-Beclin1 com energética favorável.

Em termos mecanísticos, demonstrou-se que a Neo inibe a degradação proteossomal mediada por ubiquitinação da Beclin1, estabilizando e aumentando assim sua abundância proteica intracelular. Esse aumento no nível de Beclin1 ativou a autofagia, evidenciado pela diminuição de P62 e aumento dos níveis de LC3-II. A inibição da autofagia (com 3-metiladenina ou cloroquina) atenuou os efeitos osteogênicos da Neo, confirmando que a ativação da autofagia a jusante da estabilização da Beclin1 é a via mecanística crítica. Ensaios de perseguição com cicloheximida e experimentos com o inibidor de proteassomo MG132 confirmaram ainda que o efeito da Neo opera por meio do bloqueio da degradação da Beclin1 pelo sistema ubiquitina-proteassomo, e não pelo aumento de sua transcrição.

Para a validação in vivo, hDPSCs pré-condicionadas com Neo foram semeadas em scaffolds de Bio-Oss e implantadas em defeitos calvarianos de tamanho crítico em ratos. A imagem por micro-CT e a análise histológica demonstraram formação de novo osso significativamente aumentada em comparação aos controles, estabelecendo o potencial translacional da Neo. Os autores propõem esse eixo Neo-Beclin1-autofagia como uma nova via farmacológica para a regeneração óssea e sugerem que a Neo representa uma alternativa segura, custo-efetiva e estável aos fatores osteindutores à base de proteínas recombinantes para terapias clínicas com células-tronco.