CRISPR Prime Editing Modela e Corrige Mutação Rara de GDF11 Associada a Distúrbio de Crescimento

Doenças genéticas raras e ultrarraras afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas o caminho do diagnóstico genético até uma terapia eficaz continua sendo enormemente desafiador. A Undiagnosed Diseases Network (UDN) identificou mais de 886 diagnósticos por meio de sequenciamento de genoma completo e de exoma completo, porém o desenvolvimento terapêutico para essas condições altamente individualizadas está muito aquém do necessário. Este estudo preenche essa lacuna ao demonstrar um fluxo de trabalho completo — do modelo da doença à correção da mutação — usando prime editing por CRISPR para a variante patogênica de novo de um único paciente no gene GDF11, que codifica um membro da família TGF-beta com papéis no desenvolvimento, na homeostase tecidual e no envelhecimento.

A variante específica estudada é uma transversão de C para G na posição nucleotídica 6.529 do GDF11 (NM_005811.4), criando um códon de parada prematuro na tirosina 336 (Tyr336*). Essa mutação foi identificada no participante 056 da UDN, que apresentou atraso no crescimento e anormalidades multissistêmicas. Utilizando prime editing, a equipe introduziu essa mutação heterozigótica exata em células HEK293T, gerando linhagens celulares clonais que reproduzem fielmente o genótipo do paciente. A análise por Western blot confirmou que as células heterozigotas (HET) apresentaram níveis significativamente reduzidos da proteína GDF11 em comparação com os controles do tipo selvagem, compatível com degradação pós-traducional provavelmente mediada por vias de controle de qualidade associadas ao retículo endoplasmático e ao complexo de Golgi, e não apenas pelo decaimento do mRNA mediado por nonsense.

A análise imuno-histoquímica da morfologia do complexo de Golgi por meio do marcador GOLPH2 revelou anormalidades estruturais marcantes nas células HET. Em comparação com as células do tipo selvagem, os clones HET exibiram um número significativamente maior de estruturas de Golgi compactas e de formato irregular por célula, compatível com fragmentação e estresse do Golgi. Esse achado é relevante porque GDF11 é uma proteína secretada que transita pelo complexo de Golgi, e a perturbação de seu processamento pode comprometer diretamente a homeostase do Golgi. O fenótipo do Golgi fornece um mecanismo celular que relaciona a mutação às características clínicas de desenvolvimento e multissistêmicas do paciente.

O perfil transcriptômico por RNA-seq (depositado no GEO: GSE312163) de células HEK293T do tipo selvagem versus HET revelou ampla desregulação das redes gênicas. As vias com expressão reduzida incluíam genes metabólicos e biossintéticos relacionados ao Golgi, enquanto as vias com expressão aumentada incluíam genes de adesão celular e de matriz extracelular. Essas alterações transcricionais foram interpretadas como paralelas aos fenótipos de desenvolvimento, neural e cardiovascular do participante, sustentando um mecanismo de haploinsuficiência para o alelo Tyr336*, e não um efeito dominante-negativo. A análise de enriquecimento de ontologia gênica com ShinyGO e os gráficos de vulcão gerados com VolcaNoseR forneceram suporte estatístico para essas alterações em nível de via.

Para a correção da mutação, a equipe testou sistematicamente múltiplas estratégias de prime editing variando a versão do prime editor (PE6 PEmaxΔRNaseH vs. PE7), o design do scaffold da pegRNA (padrão, tevopreq1, tmpknot) e as ferramentas de design de guia de RNA (incluindo o design baseado em IA do Pridict). PE7 combinado com uma pegRNA projetada pelo Pridict mostrou-se o complexo ribonucleoprotéico mais eficaz. A eficiência da edição foi ainda aprimorada pela incorporação de uma mutação silenciosa disruptora do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) junto à correção, o que provavelmente impede a religação da Cas9 ao alelo editado e reduz a reversão mediada pelo reparo de incompatibilidade. Os resultados da edição foram quantificados com os softwares CRISPResso2 e EditR. Em conjunto, esses resultados estabelecem um pipeline escalável e de baixo custo para modelagem de doenças raras e correção alelo-específica, que pode ser adaptado a muitas das variantes identificadas pela UDN.