Un activateur génique TIGRa ultra-compact active plusieurs gènes à partir d'un seul vecteur AAV

Beaucoup de maladies liées à l'âge et dégénératives, dont le glaucome et d'autres neuropathies optiques, nécessitent probablement des modifications coordonnées de plusieurs voies de survie et de réparation plutôt que la correction d'un seul gène. Les activateurs géniques programmables peuvent augmenter l'expression des propres gènes d'une cellule. Mais les activateurs CRISPR standard basés sur dSpCas9 (1368 acides aminés) sont trop volumineux pour un seul vecteur AAV, dont la capacité est d'environ 4,7 kb. Les activateurs plus grands exigent donc une administration par deux vecteurs, et les alternatives compactes n'ont pas permis jusqu'ici un multiplexage à grande échelle.

L'équipe de Stanford a testé huit miniprotéines guidées par ARN, dépourvues d'activité nucléase (337 à 506 acides aminés), fusionnées au domaine d'activation VPR, en ciblant le promoteur de HBB dans des cellules HEK293T. Seule la ParTasR inactive, de la famille TIGR-TasR, a donné une activation robuste (jusqu'à 7486 fois, contre 8676 fois pour le contrôle dCasMINI-VPR). Elle est devenue TIGRa. Elle utilise un court tigRNA de 36 nt, n'exige pas de PAM strict et préfère une cible de 18 nt avec environ 50 à 67 % de GC. Elle a activé 20 des 24 sites HBB testés, dont 10 de plus de 100 fois, et a aussi fonctionné sur ASCL1, IL1RN et HBG1. Sur quatre loci, TIGRa a atteint environ 0,74 de l'activité de dSpCas9 et a surpassé de 2,45 à 3,55 fois les activateurs dCasMINI, dCas12a et hyperdCas12a.

L'équipe a ensuite remplacé les domaines d'activation par des versions plus petites et ajouté des domaines auxiliaires de liaison à l'ADN. TIGRa-Mini (domaine NFZ, 540 aa) représente environ un quart de la taille de dSpCas9 et a conservé une activité proche de l'originale, environ 0,72 fois. TIGRa-Pro (NFZ plus p65, 727 aa) était environ 2,3 fois plus actif que TIGRa. TIGRa-Ultra (avec ajout du domaine de liaison à l'ADN Aho7c) était environ 4 fois plus actif. Le RNA-seq du transcriptome entier a montré que toutes les variantes augmentaient sélectivement la cible voulue, HBB, avec des profils hors cible globalement comparables à ceux du dCasMINI-VPR, de haute spécificité.

Pour le multiplexage, un réseau natif de quatre tigRNA de 36 nt (414 pb) a égalé en activation (1,16 fois) une conception classique à quatre promoteurs U6 (1224 pb) et a surpassé les conceptions à maturation par ribozyme. Le RNA-seq de petits ARN a montré que les cellules de mammifères transforment ce réseau en tigRNA individuels. Le résumé (le texte intégral fourni s'interrompt ici) indique que cela a permis l'activation simultanée de jusqu'à 12 gènes endogènes à partir d'une seule construction compacte, la reprogrammation efficace de fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites, et l'activation in vivo de la CaMKII endogène par un vecteur AAV-TIGRa tout-en-un. Dans un modèle murin de lésion rétinienne induite par le NMDA, cela a favorisé la survie des cellules ganglionnaires de la rétine et préservé la fonction visuelle.

Si ces résultats se confirment, TIGRa pourrait constituer une voie pratique vers une régulation thérapeutique multigénique avec administration par un seul vecteur. Parmi les réserves : le cadre est préclinique, la plupart des caractérisations ayant été menées dans des cellules HEK293T et un seul modèle murin de lésion aiguë. L'activation varie encore selon le site cible, et l'innocuité à long terme, l'immunogénicité et la spécificité dans les tissus humains pertinents n'ont pas encore été testées. Les détails des expériences in vivo et de reprogrammation n'étaient pas disponibles dans le texte fourni.