SPIDR Cartographie des Dizaines de Protéines de Liaison à l'RNA Simultanément, Révélant un Commutateur de Réponse au Stress

Comprendre comment les protéines de liaison à l'ARN (RBP) régulent l'expression génique est au cœur de la biologie cellulaire et de la médecine, mais le domaine a jusqu'ici manqué de méthodes permettant de cartographier plus d'une RBP à la fois. SPIDR (<i>split-and-pool identification of RBP targets</i>) comble cette lacune en combinant des conjugués billes-oligonucléotides enrobées d'anticorps avec la réticulation aux UV, une immunoprécipitation en pool et un barcoding par <i>split-pool</i>. Chaque bille porte un tag ADN unique identifiant son anticorps ; après la pulldown, le même code-barres est ligaturé à la fois au tag et à l'ARN co-purifié, ce qui permet de décoder toutes les paires protéine-ARN à partir d'un seul séquençage. Le protocole n'ajoute qu'environ une heure à un workflow CLIP standard et ne nécessite aucun équipement spécialisé.

Appliqué aux lignées cellulaires humaines K562 et HEK293T, SPIDR a permis de profiler simultanément plus de 50 RBP par expérience — 62 protéines uniques au total — couvrant des facteurs d'épissage, des régulateurs de la traduction, des enzymes de traitement de l'ARN et des composants d'ARN non codants. Les expériences en réplicats ont montré une haute reproductibilité (R de Pearson médian = 0,91 sur les régions à forte couverture) et une faible contamination croisée entre les populations de billes (> 80 % des clusters portaient une identité d'anticorps unique). La méthode a retrouvé les sites de liaison établis pour des RBP bien caractérisées, notamment PTBP1, HNRNPK, SPEN/SHARP, SLBP, LSM11, LIN28B et des protéines ribosomiques, validant ainsi sa précision sur diverses classes d'ARN.

Une découverte majeure est l'interaction entre LARP1 — une protéine associée au contrôle traductionnel dépendant de mTOR — et l'ARNr 18S de la petite sous-unité ribosomique 40S. La cryo-ME à particule unique a résolu ce complexe à 2,8 Å, plaçant LARP1 au niveau du canal d'entrée de l'ARNm du ribosome. Cette découverte structurale fournit une base mécanistique plausible à la capacité connue de LARP1 à supprimer la traduction : en occupant le canal d'entrée de l'ARNm, LARP1 pourrait physiquement bloquer le chargement du ribosome sur les ARNm cibles.

SPIDR a ensuite été utilisé pour examiner comment la liaison des RBP évolue lorsque mTOR est inhibé par la Torin-1, un puissant inhibiteur de la kinase mTOR. Dans ces conditions, 4EBP1 — un répresseur traductionnel normalement maintenu inactif par la phosphorylation médiée par mTOR — s'est préférentiellement associé aux ARNm également liés par LARP1. Ce schéma de co-occupation suggère que LARP1 et 4EBP1 agissent de manière coopérative pour imposer une répression traductionnelle sélective à un sous-ensemble spécifique d'ARNm lors d'un stress cellulaire, plutôt que de provoquer un arrêt global de la synthèse protéique.

La capacité de SPIDR à capturer des dizaines de RBP en une seule expérience efficiente en nombre de cellules le rend particulièrement adapté à l'étude des cellules primaires, des populations cellulaires rares et des modèles pathologiques où le matériel biologique est limité. Sa scalabilité à des centaines de RBP en principe le positionne comme un outil transformateur pour générer des cartes complètes et spécifiques au type cellulaire des interactions ARN-protéines — une ressource qui pourrait accélérer l'annotation fonctionnelle des milliers de RBP et d'ARN non codants dont les rôles biologiques restent inconnus.