Des petites molécules seules peuvent reprogrammer rapidement des cellules en cellules pluripotentes : voici comment
Des scientifiques découvrent comment l'épissage de l'ARN et la modification des histones interagissent pour amplifier la reprogrammation chimique, ouvrant de nouvelles perspectives pour la médecine régénérative.
Résumé
Des chercheurs peuvent désormais transformer des cellules ordinaires de type peau de souris en cellules souches en utilisant uniquement un cocktail de petites molécules, en 7 à 12 jours environ. Le mécanisme sous-jacent restait mal compris. Cette étude s'est intéressée à l'épissage de l'ARN (RNA splicing), le processus qui permet à un seul gène de produire plusieurs versions d'une protéine. L'équipe a découvert qu'un régulateur de l'épissage appelé PTBP3 agit comme un frein à la reprogrammation. Réduire son expression a presque doublé le nombre de colonies de cellules souches. PTBP3 modifie l'épissage d'un autre gène, SCMH1. SCMH1 contribue à poser sur les gènes inflammatoires un marqueur de réduction au silence des gènes, l'ubiquitination de H2AK119. La diminution de la signalisation inflammatoire a favorisé la reprogrammation, et les médicaments amlexanox et BMS-345541 ont amélioré l'efficacité encore davantage. Ces travaux ont été menés sur des cellules de souris, mais ils ouvrent des pistes pour rendre le rajeunissement et la régénération cellulaires plus sûrs et plus efficaces.
Résumé détaillé
Transformer des cellules matures en cellules souches pluripotentes est une pierre angulaire de la médecine régénérative et de la recherche sur le rajeunissement. La plupart des méthodes reposent sur des facteurs de transcription délivrés par des gènes. Cette équipe avait précédemment mis au point un système de reprogrammation chimique rapide (FCR, pour fast chemical reprogramming) qui produit des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en 7 à 12 jours, uniquement à l'aide de petites molécules, mais la biologie sous-jacente restait mal comprise. Cette étude cherche à déterminer comment le contrôle post-transcriptionnel, en particulier l'épissage alternatif (AS), façonne ce processus.
Les auteurs ont d'abord comparé l'expression des protéines de liaison à l'ARN (RBP) et l'épissage dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), des iPSC induites chimiquement (fiPSC) et des cellules souches embryonnaires. Les gènes du spliceosome constituaient la catégorie de RBP la plus enrichie. Les profils d'épissage des fiPSC se regroupaient avec ceux des cellules souches embryonnaires et se distinguaient de ceux des MEF. Environ 1 000 exons sautés différaient entre les MEF et les fiPSC. Les exons préférentiellement présents dans les MEF étaient plus courts (médiane de 86 contre 104,5 bp) et étaient flanqués d'introns plus longs (4 358 contre 3 409 bp). Les petites molécules seules ont donc remodelé le paysage d'épissage.
Un criblage par shRNA des RBP liées au spliceosome a identifié PTBP3 comme un régulateur négatif. Son knockdown a environ doublé le nombre de colonies de fiPSC sans modifier le nombre de cellules. Un second shRNA a reproduit cet effet, et un rescue avec un Ptbp3 résistant au shRNA l'a inversé. La surexpression a réduit les colonies ainsi que l'induction d'Oct4 et de Dppa5a. Le knockdown du gène apparenté Ptbp1 a eu un effet minime. Le knockdown de Ptbp3 a aussi favorisé la reprogrammation de fibroblastes pulmonaires de souris adultes, mais pas la reprogrammation par facteurs de transcription. L'inhibiteur du TGF-β 616452 a induit Ptbp3, et le knockdown de Smad2 a augmenté l'expression de Ptbp3. Les fiPSC knockdown au passage 12 exprimaient OCT4, SOX2 et NANOG et formaient les trois feuillets embryonnaires.
Le RNA-seq en bulk au jour 8 a révélé 421 gènes codant des protéines surexprimés et 630 sous-exprimés après le knockdown, dont 319 chevauchaient des données publiées de liaison de PTBP3. Les termes liés à la réponse inflammatoire et à l'activité de NF-kB ont diminué. Le petit ARN nucléolaire Rian, associé au potentiel de développement des iPSC, a augmenté, tandis que MMVL30-int, un régulateur négatif de la reprogrammation, a diminué. Le RNA-seq en cellule unique sur 21 995 cellules a montré davantage d'intermédiaires et d'iPSC naissantes après le knockdown, une surexpression des voies du lysosome, de l'autophagie, de mTOR, du protéasome et de régulation de la longévité, ainsi qu'une variabilité plus faible, le facteur de Fano diminuant dans plus de 95 % des gènes.
L'analyse de l'épissage a montré des modifications d'environ 600 événements d'exons cassettes, 800 de rétention d'intron, 200 d'Alt5 et 200 d'Alt3. Les exons cassettes proches de motifs de liaison de PTBP3 impliquaient les voies polycomb, et 93 des 211 gènes à exon cassette disposaient de preuves de liaison directe. Scmh1, un composant de PRC1, a vu son équilibre d'isoformes se modifier. Selon le résumé de l'article, l'axe PTBP3-SCMH1 régule le dépôt de H2AK119ub au niveau de gènes inflammatoires, et les inhibiteurs amlexanox et BMS-345541 ont encore amélioré l'efficacité du FCR.
Les implications sont avant tout mécanistiques. La reprogrammation chimique active ses propres freins, et l'inflammation ainsi que le contrôle de l'épissage peuvent être modulés. Limites : tous les travaux ont utilisé des cellules de souris et des shRNA, sans cellules humaines ni rajeunissement in vivo. Certaines sections ultérieures de l'article n'étaient pas disponibles pour ce résumé.
Principales conclusions
- Ptbp3 knockdown increased fiPSC colony numbers about 2-fold without changing overall cell numbers, and a second shRNA and rescue experiments confirmed the effect
- About 1,000 skipped exons differed between MEFs and fiPSCs, and fiPSC splicing profiles clustered with embryonic stem cells rather than MEFs
- Deep RNA-seq after Ptbp3 knockdown found 421 upregulated and 630 downregulated genes, 319 of which overlapped published PTBP3 binding data
- Single-cell RNA-seq of 21,995 cells showed more intermediates and nascent iPSCs after knockdown, with the Fano factor falling in over 95% of genes
- Ptbp3 knockdown shifted about 600 cassette-exon and 800 intron-retention events, and 93 of 211 cassette-exon genes showed direct PTBP3 binding, including the PRC1 component Scmh1
- Removing the TGF-β inhibitor 616452 from the cocktail sharply cut Ptbp3 expression, and Smad2 knockdown raised Ptbp3
- The anti-inflammatory compounds amlexanox and BMS-345541 further improved reprogramming efficiency (per the abstract)
Méthodologie
L'étude a utilisé des fibroblastes embryonnaires de souris et des fibroblastes pulmonaires de souris dans un protocole de reprogrammation chimique à 12 petites molécules, en comparant les fiPSC avec des cellules souches embryonnaires. Les méthodes comprenaient un criblage par shRNA évalué par la formation de colonies, des expériences de sauvetage et de surexpression, la qPCR, un RNA-seq en masse au jour 8, un scRNA-seq 10x au jour 12 (21 995 cellules), une analyse de l'épissage avec vast-tools et un profilage de H2AK119ub tout au long de la reprogrammation. Les données de colonies provenaient de trois expériences indépendantes regroupées (n = 3 chacune) et analysées par des tests t de Welch non appariés, tandis que le RNA-seq des échantillons de knockdown reposait sur n = 2 expériences indépendantes et que le scRNA-seq a été analysé avec des tests de la somme des rangs de Wilcoxon.
Limites de l'étude
Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules de souris en culture et reposaient sur un knockdown par shRNA ; la pertinence chez l'être humain, les effets in vivo et la sécurité à long terme n'ont donc pas été évalués. Les effets étaient spécifiques à la reprogrammation chimique et minimes dans la reprogrammation par facteurs de transcription, et certaines comparaisons de RNA-seq n'ont porté que sur deux réplicats. Le texte intégral ayant été tronqué pour cette analyse, les limites déclarées par les auteurs ainsi que d'éventuelles déclarations de conflits d'intérêts n'étaient pas disponibles.
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