Le Prime Editing CRISPR modélise et corrige une mutation rare de *GDF11* liée à un trouble de la croissance

Les maladies génétiques rares et ultra-rares touchent des millions de personnes dans le monde, mais le chemin qui mène d'un diagnostic génétique à une thérapie efficace reste extrêmement difficile. L'Undiagnosed Diseases Network (UDN) a identifié plus de 886 diagnostics grâce au séquençage du génome entier et de l'exome entier, mais le développement thérapeutique pour ces affections hautement individualisées est très en retard. Cette étude comble ce manque en démontrant un flux de travail complet — de la modélisation de la maladie à la correction de la mutation — à l'aide de l'édition primaire CRISPR pour le variant pathogène de novo d'un seul patient dans GDF11, un gène codant un membre de la famille TGF-bêta impliqué dans le développement, l'homéostasie tissulaire et le vieillissement.

Le variant spécifique étudié est une transversion C-en-G à la position nucléotidique 6 529 de GDF11 (NM_005811.4), créant un codon stop prématuré à la tyrosine 336 (Tyr336*). Cette mutation a été identifiée chez le participant UDN 056, qui présentait un retard de croissance et des anomalies multisystémiques. À l'aide de l'édition primaire, l'équipe a introduit cette mutation hétérozygote exacte dans des cellules HEK293T, générant des lignées cellulaires clonales qui modélisent fidèlement le génotype du patient. L'analyse par western blot a confirmé que les cellules hétérozygotes (HET) présentaient des taux de protéine GDF11 significativement réduits par rapport aux témoins de type sauvage, ce qui est cohérent avec une dégradation post-traductionnelle probablement médiée par les voies de contrôle qualité associées au réticulum endoplasmique et à l'appareil de Golgi, plutôt que par la seule dégradation des ARN messagers à médiation non-sens.

L'analyse immunohistochimique de la morphologie de l'appareil de Golgi à l'aide du marqueur GOLPH2 a révélé des anomalies structurelles frappantes dans les cellules HET. Par rapport aux cellules de type sauvage, les clones HET présentaient un nombre significativement plus élevé de structures golgiennes compactes et de forme irrégulière par cellule, ce qui est compatible avec une fragmentation et un stress de l'appareil de Golgi. Cette observation est notable car GDF11 est une protéine sécrétée qui transite par l'appareil de Golgi, et la perturbation de son traitement peut directement altérer l'homéostasie golgienne. Le phénotype golgien fournit un mécanisme cellulaire reliant la mutation aux caractéristiques cliniques développementales et multisystémiques du patient.

Le profilage transcriptomique par RNA-seq (déposé sur GEO : GSE312163) des cellules HEK293T de type sauvage par rapport aux cellules HET a révélé une dérégulation étendue des réseaux de gènes. Les voies sous-régulées comprenaient des gènes biosynthétiques métaboliques et liés au Golgi, tandis que les voies surexprimées comprenaient des gènes d'adhésion cellulaire et de matrice extracellulaire. Ces modifications transcriptionnelles ont été interprétées comme reflétant les phénotypes développementaux, neurologiques et cardiovasculaires du participant, soutenant un mécanisme d'haploinsuffisance pour l'allèle Tyr336* plutôt qu'un effet dominant négatif. L'analyse d'enrichissement des ontologies géniques à l'aide de ShinyGO et les graphiques volcano générés avec VolcaNoseR ont fourni un soutien statistique à ces modifications au niveau des voies.

Pour la correction de la mutation, l'équipe a systématiquement testé plusieurs stratégies d'édition primaire en faisant varier la version de l'éditeur primaire (PE6 PEmaxΔRNaseH vs. PE7), la conception de l'échafaudage pegRNA (standard, tevopreq1, tmpknot) et les outils de conception de l'ARN guide (notamment la conception basée sur l'IA Pridict). PE7 combiné à un pegRNA conçu par Pridict s'est avéré être le complexe ribonucléoprotéique le plus efficace. L'efficacité d'édition a été encore améliorée en incorporant une mutation silencieuse perturbant le motif adjacent au protospaceur (PAM) en parallèle de la correction, ce qui empêche probablement la liaison de Cas9 à l'allèle édité et réduit la réversion médiée par la réparation des mésappariements. Les résultats d'édition ont été quantifiés à l'aide des logiciels CRISPResso2 et EditR. Ensemble, ces résultats établissent un pipeline évolutif et rentable pour la modélisation de maladies rares et la correction allèle-spécifique, qui pourrait être adapté à de nombreux variants identifiés par UDN.