L'édition de bases dans des embryons humains inactive PCSK9 avec une efficacité quasi parfaite
Des scientifiques de Columbia ont réalisé une édition allélique de 100 % de *PCSK9* dans des embryons humains à l'aide d'éditeurs de bases, ouvrant la voie à une réduction héréditaire du LDL, mais des obstacles en matière de sécurité subsistent.
Résumé
Les cassures de l'ADN induites par Cas9 dans les embryons humains peuvent provoquer de grandes délétions et un nombre anormal de chromosomes. Les chercheurs ont testé des éditeurs de bases de l'adénine ciblant PCSK9 et HBG1/2. La protéine ABE8e(V106W), délivrée au moment de la fécondation, a édité l'ensemble des 32 allèles de PCSK9 examinés dans cinq embryons. La délivrance sous forme de protéine a permis le développement jusqu'au stade blastocyste, et aucune insertion ni délétion, petite ou grande, n'a été observée après l'édition de bases. Cependant, de rares cassures chromosomiques au niveau du site ciblé, des anomalies chromosomiques et une édition involontaire en mosaïque se sont produites. ABE8.8-m, délivré sous forme d'ARNm, a entraîné de fréquents arrêts précoces du développement embryonnaire. Les auteurs concluent que les lésions causées par les éditeurs de bases sont réparées efficacement, mais que les risques génomiques et développementaux persistants excluent pour l'instant toute utilisation clinique à visée reproductive.
Résumé détaillé
Les cassures double-brin de l'ADN induites par Cas9 sont mal réparées dans les embryons humains et peuvent entraîner de grandes délétions et des anomalies chromosomiques. Les éditeurs de bases de l'adénine introduisent à la place des coupures simple-brin (« nicks ») et des changements de bases. Cette étude a examiné les résultats de la réparation et le développement précoce après l'édition de PCSK9 et des promoteurs de HBG1/2 dans des embryons humains. PCSK9 a été ciblé par une modification destinée à perturber sa fonction ; la modification de HBG1/2 correspond à un variant associé à la persistance de l'expression de l'hémoglobine fœtale à l'âge adulte.
Les chercheurs ont délivré ABE8.8-m sous forme d'ARNm, ainsi qu'ABEmax et ABE8e(V106W) sous forme de complexes protéine–ARN guide. Les injections ont été réalisées dans des zygotes à deux pronoyaux ou dans des ovocytes en métaphase II au moment de la fécondation. L'édition a été évaluée par séquençage de Sanger, avec en complément un séquençage de nouvelle génération pour l'analyse de HBG.
La protéine ABEmax délivrée au stade à deux pronoyaux a produit des modifications homozygotes de PCSK9 dans 47 blastomères sur 77 (61 %) ; l'ARNm d'ABE8.8-m a produit des modifications homozygotes dans 42 cellules sur 64 (66 %). La protéine ABE8e(V106W) délivrée au moment de la fécondation a édité la totalité des 32 allèles cibles examinés dans des cellules et des pronoyaux issus de cinq embryons. Le résumé rapporte également l'obtention de lignées de cellules souches éditées homozygotes.
Le mode d'administration a influencé le développement. Sur 44 embryons injectés avec l'ARNm d'ABE8.8-m, 38 (86 %) se sont arrêtés au stade de une à quatre cellules et deux ont atteint le stade blastocyste. Un éditeur inactif a significativement amélioré le développement par rapport à l'éditeur actif (P=0,0081, test de Kruskal–Wallis). Un arrêt du développement est aussi survenu sans ARN guide, ce qui suggère une activité désaminase indépendante du guide. Avec les complexes protéine–ARN guide d'ABEmax ou d'ABE8e(V106W), le développement jusqu'au stade blastocyste était similaire à celui des témoins, et aucun arrêt précoce n'a été observé, quel que soit le stade d'injection.
Aucune insertion ni délétion, petite ou grande, n'a été observée après l'édition de bases. Néanmoins, de rares cassures chromosomiques et anomalies chromosomiques au niveau de la cible sont survenues, et l'édition de bases voisines (« bystander ») et hors cible était en mosaïque. Ainsi, une édition réussie de la cible et un développement jusqu'au stade blastocyste n'ont pas établi l'innocuité génomique.
Les auteurs concluent que les lésions induites par les éditeurs de bases sont réparées efficacement par rapport aux cassures de l'ADN induites par Cas9, mais que les effets indésirables génomiques et développementaux excluent actuellement toute utilisation clinique en reproduction. Il s'agit de résultats obtenus sur des embryons en laboratoire, et non de preuves d'une grossesse sans danger, d'une descendance en bonne santé ou d'une prévention clinique de maladies.
Principales conclusions
- ABE8e(V106W) protein delivered at fertilization edited all 32 PCSK9 target alleles examined in cells and pronuclei from 5 human embryos
- ABE8.8-m mRNA arrested 38 of 44 embryos (86%) at the one-to-four-cell stage; 2 reached blastocysts, and an inactive editor improved development (P=0.0081)
- No insertions or small or large deletions were observed after base editing, but rare on-target chromosome breakages and chromosomal abnormalities occurred
- ABEmax and ABE8e(V106W) protein–guide complexes supported blastocyst development similar to controls, with no early arrest observed at either injection stage
- The researchers derived homozygous edited stem cell lines, as reported in the abstract
- Bystander and off-target editing was mosaic, leaving genomic risks despite efficient intended editing
- Arrest also occurred when ABE8.8-m mRNA was delivered without guide RNA, implicating guide-independent deaminase activity
Méthodologie
Des zygotes humains à deux pronucléi et des ovocytes en métaphase II, au moment de la fécondation, ont reçu des éditeurs de bases adénine ciblant *PCSK9* et/ou *HBG1/2*. ABE8.8-m a été administré sous forme de mRNA ; ABEmax et ABE8e(V106W) l'ont été sous forme de complexes protéine–RNA guide. Le texte fourni décrit un séquençage de Sanger des blastomères et des pronucléi, un séquençage de nouvelle génération pour l'analyse de *HBG*, un suivi du développement jusqu'au sixième jour, ainsi que des témoins injectés avec un placebo (mock) et des témoins avec un éditeur inactif. La comparaison entre le mRNA actif et le mRNA inactif a reposé sur un test de Kruskal–Wallis. Le résumé rapporte également la dérivation de lignées de cellules souches éditées homozygotes.
Limites de l'étude
Le résultat d'édition complète de *PCSK9* reposait sur 32 allèles examinés dans cinq embryons et ne doit pas être généralisé à tous les embryons ni à tous les protocoles d'édition. Le développement jusqu'au stade blastocyste n'établit pas l'innocuité sur le plan du développement ultérieur ni de la reproduction. Des anomalies chromosomiques rares, ainsi qu'une édition mosaïque non ciblée (« bystander ») et des effets hors cible, persistaient. Les expériences d'arrêt du développement associées à l'mRNA ont mis en cause une activité désaminase indépendante du guide. L'extrait fourni se termine en milieu de phrase et ne permet pas de corroborer les détails supplémentaires sur les tests, les résultats quantitatifs concernant les effets hors cible ni les limites de la comparaison des modes d'administration figurant dans le résumé d'origine.
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