L'enzyme bactérienne ApaH décape les signaux d'ARN de stress via deux orientations de liaison

Les dinucléoside tétraphosphates (Np4N) sont des molécules anciennes et énigmatiques présentes dans tous les domaines du vivant, dont les concentrations intracellulaires augmentent considérablement lors du stress bactérien. Des découvertes récentes ont montré que ces « alarmones » peuvent être incorporées sous forme de coiffes à l'extrémité 5′ des ARNm bactériens et des petits ARN, reliant directement les signaux de stress cellulaire à la régulation génique. Chez <em>E. coli</em>, l'enzyme ApaH est la principale enzyme responsable du retrait de ces coiffes dans les conditions non stressées, initiant ainsi la dégradation de l'ARN dépendante de l'extrémité 5′. La compréhension du mécanisme d'ApaH est devenue urgente, étant donné que sa délétion rend les bactéries plus sensibles aux antibiotiques et au stress — ce qui en fait une cible prometteuse pour les potentialisateurs d'antibiotiques.

L'équipe de recherche a mené une investigation biochimique et structurale approfondie d'ApaH chez <em>E. coli</em>, résolvant plusieurs structures cristallographiques aux rayons X : l'enzyme apo, l'enzyme liée à des produits nucléoside diphosphate (NDP) (ADP, GDP, CDP, UDP), l'enzyme liée à des substrats Np4N, et l'enzyme liée au NAD+. Ils ont découvert qu'ApaH possède un groupe binucléaire de manganèse (Mn2+) en son cœur catalytique, avec une molécule d'eau (W1) positionnée avec précision pour une attaque nucléophile en ligne sur le β-phosphate du substrat. Les ions Mn2+ accélèrent considérablement la catalyse (~100 fois par rapport au Mg2+ seul), et un arrangement en « triple fourche » des résidus Asn65, Arg184 et Lys197 reconnaît les phosphates γ et δ distaux des substrats Np4N.

Dans les expériences biochimiques, ApaH a hydrolysé tous les variants Np4N testés (symétriques et asymétriques) à des vitesses similaires, ne différant pas de plus de 3 fois, démontrant une large promiscuité de substrat. Pour le décoiffage de l'ARN, l'enzyme n'a montré aucune préférence significative selon le nombre de nucléotides 5′ non appariés, l'identité du nucléotide en position +1, ou la nucléobase à l'intérieur de la coiffe elle-même. De manière importante, cette promiscuité s'est étendue à diverses cibles biologiquement pertinentes : ApaH a décoiffé efficacement plusieurs ARNm et petits ARN (sARN), influençant directement leurs demi-vies cellulaires.

La découverte mécanistiquement la plus significative est qu'ApaH peut lier ses substrats Np4N et Np4-ARN en deux orientations alternatives au sein du site actif. L'analyse structurale a montré que le site de liaison au nucléoside (la poche « position 0 ») est superficiel et principalement aliphatique, s'appuyant sur des interactions CH-π non spécifiques avec Trp249 et Ser230 plutôt que sur des liaisons hydrogène spécifiques à la séquence. Cette reconnaissance quasi-symétrique permet aux substrats de s'arrimer avec l'un ou l'autre nucléoside dans la poche de liaison. Des simulations de dynamique moléculaire ont soutenu l'idée qu'une orientation est modérément préférée, mais que les deux sont catalytiquement productives et génèrent les mêmes produits de clivage (NDP et ppARN).

Ces résultats ont des implications directes pour le développement de médicaments. Les inhibiteurs conçus pour imiter le substrat dans une orientation — une stratégie courante de conception rationnelle de médicaments — pourraient ne pas bloquer la catalyse si l'enzyme accommode simplement l'inhibiteur ou le substrat naturel dans l'orientation alternative. Ce mécanisme d'« échappement par orientation » devrait être pris en compte lors du ciblage d'ApaH ou d'enzymes structurellement similaires possédant des substrats pseudo-symétriques. L'étude établit ApaH d'<em>E. coli</em> comme prototype de la classe symétrique des hydrolases Np4N et fournit le cadre mécanistique le plus détaillé à ce jour pour cette famille d'enzymes.