Ultrakompakter TIGRa-Genaktivator schaltet mehrere Gene mit einem einzigen AAV-Vektor an

Viele altersbedingte und degenerative Erkrankungen, darunter das Glaukom und andere Optikusneuropathien, erfordern wahrscheinlich koordinierte Veränderungen in mehreren Überlebens- und Reparaturwegen und nicht die Korrektur eines einzelnen Gens. Programmierbare Genaktivatoren können die Expression der körpereigenen Gene einer Zelle erhöhen. Die gängigen CRISPR-Aktivatoren auf Basis von dSpCas9 (1368 Aminosäuren) sind jedoch zu groß für einen einzelnen AAV-Vektor, der etwa 4,7 kb fasst. Größere Aktivatoren erfordern daher eine Zwei-Vektor-Verabreichung, und kompakte Alternativen boten bisher kein skalierbares Multiplexing.

Das Team aus Stanford testete acht nukleasedeaktivierte, miniaturisierte RNA-geführte Proteine (337-506 Aminosäuren), die mit der Aktivierungsdomäne VPR fusioniert waren, und zielte in HEK293T-Zellen auf den HBB-Promotor. Nur das inaktive ParTasR aus der TIGR-TasR-Familie bewirkte eine robuste Aktivierung (bis zum 7486-Fachen, verglichen mit dem 8676-Fachen bei der Kontrolle dCasMINI-VPR). Daraus wurde TIGRa. Es verwendet eine kurze, 36 Nukleotide lange tigRNA, hat keine strikte PAM-Anforderung und bevorzugt ein 18-nt-Ziel mit etwa 50-67 % GC-Gehalt. Es aktivierte 20 von 24 getesteten HBB-Stellen, davon 10 um mehr als das 100-Fache, und funktionierte auch bei ASCL1, IL1RN und HBG1. Über vier Loci hinweg erreichte TIGRa etwa 0,74 der Aktivität von dSpCas9 und übertraf die Aktivatoren dCasMINI, dCas12a und hyperdCas12a um das 2,45- bis 3,55-Fache.

Anschließend tauschte das Team kleinere Aktivierungsdomänen ein und fügte zusätzliche DNA-bindende Domänen hinzu. TIGRa-Mini (NFZ-Domäne, 540 Aminosäuren) ist etwa ein Viertel so groß wie dSpCas9 und behielt mit etwa dem 0,72-Fachen eine Aktivität nahe am Original. TIGRa-Pro (NFZ plus p65, 727 Aminosäuren) war etwa 2,3-fach aktiver als TIGRa. TIGRa-Ultra (mit zusätzlicher DNA-bindender Domäne Aho7c) war etwa 4-fach aktiver. Die RNA-seq des gesamten Transkriptoms zeigte, dass alle Varianten selektiv das beabsichtigte HBB-Ziel hochregulierten, mit Off-Target-Profilen, die weitgehend mit dem hochspezifischen dCasMINI-VPR vergleichbar waren.

Für das Multiplexing erreichte ein natives Array aus vier 36-nt-tigRNAs (414 bp) bei der Aktivierung (1,16-fach) dasselbe Niveau wie ein herkömmliches Design mit vier U6-Promotoren (1224 bp) und übertraf Designs mit Ribozym-Prozessierung. Die Small-RNA-seq zeigte, dass Säugetierzellen das Array in einzelne tigRNAs prozessieren. Laut Abstract (der bereitgestellte Volltext bricht an dieser Stelle ab) ermöglichte dies die gleichzeitige Aktivierung von bis zu 12 endogenen Genen mit einem kompakten Konstrukt, die effiziente Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen und die In-vivo-Aktivierung von endogenem CaMKII durch einen All-in-one-AAV-TIGRa-Vektor. In einem Mausmodell der NMDA-induzierten Netzhautschädigung förderte dies das Überleben der retinalen Ganglienzellen und erhielt die Sehfunktion.

Sollten sich diese Ergebnisse bestätigen, könnte TIGRa ein praktikabler Weg zur therapeutischen Regulation mehrerer Gene mit Ein-Vektor-Verabreichung sein. Zu den Einschränkungen gehört der präklinische Rahmen: Der Großteil der Charakterisierung erfolgte in HEK293T-Zellen und in einem einzigen akuten Verletzungsmodell an Mäusen. Die Aktivierung variiert weiterhin je nach Zielstelle, und Langzeitsicherheit, Immunogenität und Spezifität in relevanten menschlichen Geweben sind noch nicht untersucht. Die Details der In-vivo- und Reprogrammierungsexperimente lagen im bereitgestellten Text nicht vor.