Kleine Moleküle allein können Zellen schnell zur Pluripotenz umprogrammieren – so funktioniert es
Wissenschaftler entschlüsseln, wie RNA-Spleißen und Histonmodifikation zusammenwirken, um die chemische Reprogrammierung deutlich zu beschleunigen – und eröffnen damit neue Möglichkeiten für die regenerative Medizin.
Zusammenfassung
Forschende können gewöhnliche Hautzellen der Maus inzwischen allein mit einem Cocktail aus kleinen Molekülen in etwa 7 bis 12 Tagen in Stammzellen umwandeln. Wie das genau funktioniert, war bislang unklar. Diese Studie untersuchte das RNA-Spleißen, den Prozess, durch den ein einzelnes Gen mehrere Proteinvarianten hervorbringen kann. Das Team stellte fest, dass ein Spleißregulator namens PTBP3 die Reprogrammierung bremst. Wurde seine Aktivität herabgesetzt, verdoppelte sich die Zahl der Stammzellkolonien ungefähr. PTBP3 verändert, wie ein anderes Gen, *SCMH1*, gespleißt wird. SCMH1 hilft dabei, eine genabschaltende Markierung, die H2AK119-Ubiquitinierung, an Entzündungsgenen zu setzen. Eine geringere Entzündungssignalgebung förderte die Reprogrammierung, und die Wirkstoffe Amlexanox und BMS-345541 steigerten die Effizienz noch weiter. Die Arbeit wurde an Mauszellen durchgeführt, weist aber Wege auf, die Verjüngung und Regeneration von Zellen sicherer und effizienter zu machen.
Detaillierte Zusammenfassung
Das Umprogrammieren reifer Zellen zurück in pluripotente Stammzellen ist ein Eckpfeiler der regenerativen Medizin und der Verjüngungsforschung. Die meisten Methoden beruhen auf per Gentransfer eingebrachten Transkriptionsfaktoren. Dieses Team hat zuvor ein System zur schnellen chemischen Reprogrammierung (fast chemical reprogramming, FCR) entwickelt, das allein mit kleinen Molekülen innerhalb von 7 bis 12 Tagen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) erzeugt. Die zugrunde liegende Biologie war jedoch kaum verstanden. Diese Studie fragt, wie die posttranskriptionelle Kontrolle, insbesondere das alternative Spleißen (AS), diesen Prozess prägt.
Die Autoren verglichen zunächst die Expression RNA-bindender Proteine (RBP) und das Spleißen in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs), chemisch induzierten iPSCs (fiPSCs) und embryonalen Stammzellen. Spleißosom-Gene bildeten die am stärksten angereicherte RBP-Kategorie. Die Spleißprofile der fiPSCs gruppierten sich mit denen embryonaler Stammzellen und getrennt von denen der MEFs. Rund 1.000 übersprungene Exons (Skipped Exons) unterschieden sich zwischen MEFs und fiPSCs. Exons, die in MEFs bevorzugt vorkamen, waren kürzer (Median 86 vs. 104,5 bp) und hatten längere flankierende Introns (4.358 vs. 3.409 bp). Kleine Moleküle allein formten also die Spleißlandschaft um.
Ein shRNA-Screen spleißosomaler RBPs identifizierte PTBP3 als negativen Regulator. Dessen Herunterregulierung (Knockdown) verdoppelte die Zahl der fiPSC-Kolonien ungefähr, ohne die Zellzahl zu verändern. Eine zweite shRNA reproduzierte dies, und eine Rettung mit einem shRNA-resistenten Ptbp3 hob den Effekt wieder auf. Eine Überexpression unterdrückte die Kolonien sowie die Induktion von Oct4 und Dppa5a. Der Knockdown des verwandten Ptbp1 hatte nur minimale Wirkung. Der Ptbp3-Knockdown half auch bei adulten Lungenfibroblasten der Maus, nicht jedoch bei der Reprogrammierung mit Transkriptionsfaktoren. Der TGF-β-Inhibitor 616452 induzierte Ptbp3, und ein Smad2-Knockdown erhöhte die Ptbp3-Expression. Knockdown-fiPSCs der Passage 12 exprimierten OCT4, SOX2 und NANOG und bildeten alle drei Keimblätter.
Die Bulk-RNA-Seq an Tag 8 ergab nach dem Knockdown 421 hochregulierte und 630 herunterregulierte proteinkodierende Gene, von denen 319 mit veröffentlichten PTBP3-Bindungsdaten überlappten. Begriffe zu Entzündungsreaktion und NF-kB-Aktivität nahmen ab. Die kleine nukleoläre RNA Rian, die mit dem Entwicklungspotenzial von iPSCs in Verbindung steht, nahm zu, während der negative Reprogrammierungsregulator MMVL30-int abnahm. Die Einzelzell-RNA-Seq von 21.995 Zellen zeigte nach dem Knockdown mehr Zwischenstadien und entstehende iPSCs, hochregulierte Signalwege für Lysosom, Autophagie, mTOR, Proteasom und die Regulation der Langlebigkeit sowie eine geringere Variabilität: Der Fano-Faktor sank bei über 95 % der Gene.
Die Spleißanalyse fand etwa 600 veränderte Kassettenexon-, 800 Intron-Retentions-, 200 Alt5- und 200 Alt3-Ereignisse. Kassettenexons in der Nähe von PTBP3-Bindungsmotiven wiesen auf Polycomb-Signalwege hin, und bei 93 von 211 Genen mit Kassettenexons gab es direkte Bindungsbelege. Scmh1, eine PRC1-Komponente, verschob sein Isoformenverhältnis. Laut Zusammenfassung reguliert die PTBP3-SCMH1-Achse die H2AK119ub-Ablagerung an Entzündungsgenen, und die Inhibitoren Amlexanox und BMS-345541 verbesserten die FCR-Effizienz weiter.
Die Implikationen sind überwiegend mechanistischer Natur. Die chemische Reprogrammierung aktiviert ihre eigenen Bremsen, und Entzündung sowie Spleißkontrolle lassen sich gezielt steuern. Einschränkungen: Alle Arbeiten verwendeten Mauszellen und shRNA, es gab keine menschlichen Zellen und keine Verjüngung in vivo. Einige spätere Abschnitte der Arbeit standen für diese Zusammenfassung nicht zur Verfügung.
Wichtigste Erkenntnisse
- Ptbp3 knockdown increased fiPSC colony numbers about 2-fold without changing overall cell numbers, and a second shRNA and rescue experiments confirmed the effect
- About 1,000 skipped exons differed between MEFs and fiPSCs, and fiPSC splicing profiles clustered with embryonic stem cells rather than MEFs
- Deep RNA-seq after Ptbp3 knockdown found 421 upregulated and 630 downregulated genes, 319 of which overlapped published PTBP3 binding data
- Single-cell RNA-seq of 21,995 cells showed more intermediates and nascent iPSCs after knockdown, with the Fano factor falling in over 95% of genes
- Ptbp3 knockdown shifted about 600 cassette-exon and 800 intron-retention events, and 93 of 211 cassette-exon genes showed direct PTBP3 binding, including the PRC1 component Scmh1
- Removing the TGF-β inhibitor 616452 from the cocktail sharply cut Ptbp3 expression, and Smad2 knockdown raised Ptbp3
- The anti-inflammatory compounds amlexanox and BMS-345541 further improved reprogramming efficiency (per the abstract)
Methodik
Die Studie verwendete embryonale Mausfibroblasten und Lungenfibroblasten der Maus in einem chemischen Reprogrammierungsprotokoll mit 12 niedermolekularen Substanzen und verglich fiPSCs mit embryonalen Stammzellen. Zu den Methoden gehörten ein shRNA-Screen, der anhand der Koloniebildung bewertet wurde, Rescue- und Überexpressionsexperimente, qPCR, Bulk-RNA-Seq an Tag 8, 10x-scRNA-Seq an Tag 12 (21.995 Zellen), eine Spleißanalyse mit vast-tools sowie H2AK119ub-Profiling über die gesamte Reprogrammierung hinweg. Die Koloniedaten stammten aus drei gepoolten unabhängigen Experimenten (jeweils n = 3) und wurden mit Welch-t-Tests für unabhängige Stichproben analysiert, während die RNA-Seq der Knockdown-Proben n = 2 unabhängige Experimente umfasste und die scRNA-Seq mit Wilcoxon-Rangsummentests ausgewertet wurde.
Studienlimitierungen
Alle Experimente wurden an Mauszellen in Kultur durchgeführt und stützten sich auf shRNA-Knockdown. Die Relevanz für den Menschen, Auswirkungen in vivo und die langfristige Sicherheit sind daher nicht untersucht. Die Effekte waren spezifisch für die chemische Reprogrammierung und bei der Reprogrammierung mit Transkriptionsfaktoren minimal; zudem basierten einige RNA-seq-Vergleiche auf nur zwei Replikaten. Der Volltext lag für diese Analyse nur gekürzt vor, sodass die von den Autoren genannten Einschränkungen sowie etwaige Angaben zu Interessenkonflikten nicht verfügbar waren.
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