Natürliches Flavonoid Neoeriocitrin steigert die stammzellbasierte Knochenregeneration durch Autophagie

Knochendefektregeneration bleibt eine große klinische Herausforderung, und aktuelle Strategien, die auf Wachstumsfaktoren wie BMP-2 setzen, bergen ernsthafte Risiken – darunter ektope Ossifikation und Tumorigenese – sowie hohe Kosten und Instabilität. Humane dentale Pulpastammzellen (hDPSCs), gewonnen aus extrahierten Zähnen mit geringer Immunogenität und starkem osteogenem Potenzial, bieten eine überzeugende alternative Zellquelle – sie benötigen jedoch wirksame und sichere osteoinduktive Agenzien, um ihren knochenbildenden Phänotyp zu aktivieren.

Diese Studie untersuchte Neoeriocitrin (Neo), ein natürliches Flavonoid aus Zitrusfrüchten und Drynaria fortunei, als neuartiges osteoinduktives Agens für hDPSCs. In vitro steigerte die Neo-Behandlung die hDPSC-Proliferation dosisabhängig bei nicht-toxischen Konzentrationen und regulierte die Expression osteogener Marker – darunter Runx2, Kollagen I, alkalische Phosphatase (ALP) und Osteopontin (OPN) – signifikant hoch; zudem zeigte sich eine erhöhte Kalziummineralisierung, gemessen mittels Alizarinrot-Färbung an Tag 21.

Zur Identifizierung des direkten molekularen Ziels von Neo setzten die Forscher das thermische Proteom-Profiling (TPP) ein – eine proteomweite, unvoreingenommene Methode zur Identifizierung von Wirkstoffzielen, die den zellulären thermischen Shift-Assay (CETSA) mit quantitativer Tandem-Mass-Tag-(TMT-)Massenspektrometrie kombiniert. Unter den am stärksten thermisch stabilisierten Proteinen erwies sich Beclin1, ein zentraler Regulator der Autophagieinitiation, als primäres direktes Bindungsziel. Dieser Befund wurde durch unabhängige CETSA-Experimente, molekulares Docking (unter Verwendung von PDB: 6HOJ und AutoDock) sowie molekulardynamische Simulationen (GROMACS) validiert, die stabile Neo-Beclin1-Bindungsinteraktionen mit günstiger Energetik bestätigten.

Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass Neo die ubiquitinierungsvermittelte proteasomale Degradation von Beclin1 hemmt, wodurch dessen intrazelluläre Proteinmenge stabilisiert und erhöht wird. Dieser erhöhte Beclin1-Spiegel aktivierte die Autophagie, erkennbar an verringerten P62- und erhöhten LC3-II-Spiegeln. Die Hemmung der Autophagie (mittels 3-Methyladenin oder Chloroquin) schwächte die osteogenen Effekte von Neo ab, was bestätigt, dass die Autophagieaktivierung nachgeschaltet der Beclin1-Stabilisierung den entscheidenden mechanistischen Signalweg darstellt. Cycloheximid-Chase-Assays und Experimente mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 bestätigten weiterhin, dass der Effekt von Neo durch die Blockierung des Ubiquitin-Proteasom-vermittelten Abbaus von Beclin1 vermittelt wird und nicht durch eine Steigerung seiner Transkription.

Zur In-vivo-Validierung wurden mit Neo vorkonditionierte hDPSCs auf Bio-Oss-Scaffolds ausgesät und in kritisch große Schädeldefekte von Ratten implantiert. Mikro-CT-Bildgebung und histologische Analysen zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine signifikant verbesserte Neuknochenbidlung und belegten damit das translationale Potenzial von Neo. Die Autoren schlagen diese Neo-Beclin1-Autophagie-Achse als neuartigen pharmakologisch adressierbaren Signalweg für die Knochenregeneration vor und legen nahe, dass Neo eine sichere, kostengünstige und stabile Alternative zu rekombinanten proteinbasierten osteoinduktiven Faktoren für klinische Stammzelltherapien darstellt.