DNA-Aptamere identifizieren seneszente Zellen präzise ohne vorheriges Zielwissen

Zelluläre Seneszenz – ein irreversibler Zellzyklusarrest, der durch Stress oder Schäden ausgelöst wird – trägt durch den pro-inflammatorischen seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) zur Alterung und altersbedingten Krankheit bei. Ein seit Langem bestehendes Problem in diesem Forschungsfeld ist das Fehlen eines einzigen universellen Biomarkers; Forscher müssen mehrere Indikatoren kombinieren (p16, p21, SA-β-Gal, SASP-Faktoren, Morphologie), um seneszente Zellen zuverlässig zu identifizieren. Diese Lücke erschwert sowohl die Grundlagenforschung als auch die Entwicklung von Senolytika, die seneszente Zellen selektiv eliminieren müssen, ohne gesundes Gewebe zu schädigen.

Um dieses Problem anzugehen, wandte das Team der Mayo Clinic die Methode der Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX) an – ein iteratives In-vitro-Selektionsverfahren –, um einzelsträngige DNA-Aptamere direkt gegen seneszente adulte Mausfibroblasten (MAFs) zu entwickeln. Die Seneszenz wurde mit Etoposid induziert und durch SA-β-Gal-Färbung, morphologische Veränderungen, RT-qPCR von p16/p21/SASP-Markern und den Verlust von Ki67 streng validiert. Naive Bibliotheken mit Billionen zufälliger 80-mer-DNAs wurden über neun Runden zyklisch eingesetzt: Aptamere wurden zunächst gegen gesunde MAFs depletiert (Gegenselektion) und anschließend positiv auf seneszenten MAFs selektiert. Die Anreicherung der Bibliothek wurde mittels qPCR und Next-Generation-Sequenzierung verfolgt.

Ab Runde 7 stieg die Ausbeute deutlich an und blieb bis Runde 9 konstant. Die Tiefensequenzierung bestätigte eine Konvergenz der Bibliothek ab Runde 5. Zehn Kandidaten-Aptamere wurden synthetisiert und gescreent. Alle zehn banden seneszente MAFs stärker als Kontrollzellen, gemessen im qPCR-Rückgewinnungsassay; sechs zeigten eine statistisch signifikante Vorzugsfärbung mittels fluoreszierender Streptavidin-Biotin-Bildgebung auf einer IncuCyte-Plattform. Entscheidend ist, dass die Bindung kein Artefakt verlängerter Kultivierung war: Serumgehungerte Kontrollzellen zeigten keine Aptamerbindung, doch eine Trypsinbehandlung seneszenter Zellen reduzierte die Bindung deutlich, was auf ein Zelloberflächenprotein oder ein Protein der extrazellulären Matrix als Zielstruktur hindeutet.

Es wurde festgestellt, dass zwei Aptamere – 6757 und 6758 – Fibronektin binden, und zwar eine Form, die spezifisch auf seneszenten Zellen vorkommt, mit sub-nanomolarer Affinität selbst in komplexen Proteingemischen. Die Aptamere zeigten eine breite Selektivität über mehrere seneszente Zelltypen hinweg (einschließlich strahleninduzierter und onkogeninduzierter Seneszenz) sowie über mehrere Mauszelllinien, was darauf hindeutet, dass das von ihnen erkannte Fibronektin-Epitop ein allgemeines Merkmal des seneszenten Phänotyps ist und nicht spezifisch für eine bestimmte Induktionsmethode. In gealterten Mauslungengeweben zeigte ein Aptamer im Vergleich zu jungen Kontrollen eine signifikant erhöhte Färbung, und diese Färbung war in transgenen INK-ATTAC-Mäusen, bei denen p16-exprimierende seneszente Zellen pharmakogenetisch eliminiert worden waren, deutlich reduziert – was eine überzeugende In-vivo-Validierung liefert.

Diese Studie belegt, dass ein unvoreingenommenes zellbasiertes SELEX seneszenzspezifische DNA-Reagenzien generieren kann, ohne dass ein vorheriges Wissen über das molekulare Ziel erforderlich ist. Die identifizierten Aptamere, insbesondere jene, die auf Fibronektin abzielen, könnten als diagnostische Bildgebungsmittel, als Werkzeuge zur Reinigung oder Quantifizierung seneszenter Zellen oder als Zielmoleküle für Aptamer-Wirkstoff-Konjugat-Senolytika dienen – analog zu Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, jedoch potenziell kostengünstiger und chemisch zugänglicher.