Krebsmedikament GSK461364 hemmt NLRP3-Inflammasom-bedingte Entzündungen bei Mäusen
Eine PLK1-hemmende Krebssubstanz blockiert die Assemblierung des NLRP3-Inflammasoms, indem sie die Phosphorylierung von NEK7 verhindert, und lindert bei Mäusen Endotoxämie und Kolitis.
Zusammenfassung
Überaktive NLRP3-Inflammasomen treiben viele Entzündungserkrankungen an, doch die meisten Wirkstoffe, die auf NLRP3 abzielen, sind in der klinischen Entwicklung ins Stocken geraten. Forschende testeten 429 Kinase-Inhibitoren in Makrophagen von Mäusen und fanden mit GSK461364, einem PLK1-Inhibitor, der bereits in Krebsstudien untersucht worden war, einen Wirkstoff, der die NLRP3-abhängige Freisetzung von IL-1β stark hemmte. Auf AIM2- oder NLRC4-Inflammasomen hatte er keine Wirkung. Bei Mäusen verringerte er die Entzündung bei LPS-induzierter Endotoxämie und DSS-induzierter Kolitis, ohne dass über 9 Tage sichtbare Toxizität auftrat. Mechanistisch scheint PLK1 NEK7 zu phosphorylieren, wahrscheinlich an Ser221 und Ser260, was die für den Aufbau des Inflammasoms nötige Bindung zwischen NEK7 und NLRP3 verstärkt. Die Hemmung von PLK1 verringert diese Phosphorylierung und damit die Aktivierung des Inflammasoms. Die Arbeit ist präklinisch, legt aber nahe, PLK1-Inhibitoren für NLRP3-getriebene Entzündungen umzuwidmen.
Detaillierte Zusammenfassung
Der NLRP3-Inflammasom ist ein Proteinkomplex, der die Aktivierung von Caspase-1, die Freisetzung von IL-1β und den pyroptotischen Zelltod auslöst. Seine Überaktivierung wird mit Kolitis, Gicht, Atherosklerose, Sepsis und Typ-2-Diabetes in Verbindung gebracht, die alle für „Inflammaging“ relevant sind. Viele direkte NLRP3-Inhibitoren wie MCC950 sind klinisch gescheitert, weshalb neue Zielstrukturen und Wirkstoffe benötigt werden.
Das Team testete eine Bibliothek mit 429 Kinaseinhibitoren in LPS-geprimten peritonealen Makrophagen der Maus, die mit Nigericin stimuliert wurden. Die Substanzen wurden erst nach dem Priming zugegeben, um Effekte auf den Priming-Schritt zu vermeiden. Sechs Substanzen senkten IL-1β, ohne TNF-α zu verringern, darunter vier mit bereits berichteter NLRP3-hemmender Aktivität, was den Screen validierte. Die sechste, GSK461364, ein PLK1-Inhibitor, war neu. Bei 10 µM blockierte sie nach ATP, Nigericin oder MSU die IL-1β-Freisetzung, die LDH-Freisetzung (Zelltod), die Spaltung von Caspase-1 sowie die ASC-Oligomerisierung und die Bildung von ASC-Specks. Auf die AIM2- und NLRC4-Inflammasomen hatte sie kaum Einfluss, was auf eine NLRP3-Selektivität hindeutet.
In vivo senkte intraperitoneal verabreichtes GSK461364 (10 und 25 mg/kg) bei LPS-Endotoxämie das Serum-IL-1β, nicht aber TNF-α oder IL-6. Es verringerte außerdem die Lungenentzündung sowie die Spaltung von GSDMD und Caspase-1. Bei DSS-Kolitis verringerte es Gewichtsverlust, Krankheitsaktivitätswerte, Verkürzung des Kolons, Gewebeschäden und die ASC-Oligomerisierung im Kolon. Eine Dosis von 25 mg/kg über 9 Tage führte weder zu Veränderungen des Körpergewichts, der Leber- oder Nierenwerte noch der Organhistologie, und in kultivierten Zellen trat bei 1–20 µM keine Zytotoxizität auf.
Der Wirkstoff veränderte weder die mitochondriale Schädigung, die mitochondrialen ROS, den Kalium- oder Chlorid-Efflux noch die Expression von Inflammasom-Komponenten. GSK461364 band an PLK1 (SPR-KD etwa 5,21 µM), das Silencing von PLK1 ahmte seine Effekte nach, und der Wirkstoff verlor in PLK1-gesilencten Zellen seine Aktivität. PLK1 interagierte mit NEK7, nicht jedoch mit NLRP3. Knockdown oder Hemmung von PLK1 verringerte die Nigericin-induzierte Ser/Thr-Phosphorylierung von NEK7 und schwächte die Assoziation von NEK7 und NLRP3. In-vitro-Kinase-Assays (Phos-tag, ADP-Glo) zeigten eine direkte Phosphorylierung von NEK7 durch PLK1, die GSK461364 verringerte. Die NEK7-Mutanten S221A und S260A beeinträchtigten die IL-1β-Produktion in rekonstituierten HEK293T-Zellen.
Die Ergebnisse skizzieren eine PLK1/NEK7/NLRP3-Achse und stützen die Umwidmung von PLK1-Inhibitoren für Entzündungserkrankungen. Wichtige Einschränkungen: Die Daten stammen aus Maus- und Zellmodellen, die Phosphorylierungsstellen werden als „wahrscheinlich“ beschrieben (mutationsbasiert und vorhergesagt, nicht massenspektrometrisch bestätigt), und die PLK1-Hemmung hat antimitotische Effekte, die eine chronische Anwendung begrenzen könnten. Die Arbeit steht zudem im Widerspruch zu anderen Berichten über die Rolle von PLK1 und PLK4 in der NLRP3-Regulation.
Wichtigste Erkenntnisse
- Screening 429 kinase inhibitors identified GSK461364, a PLK1 inhibitor, as a selective NLRP3 inflammasome blocker with little effect on AIM2 or NLRC4.
- GSK461364 reduced serum IL-1β, lung inflammation and GSDMD/caspase-1 cleavage in LPS endotoxemia, and eased DSS colitis in mice.
- PLK1 phosphorylates NEK7, likely at Ser221 and Ser260, enhancing NEK7-NLRP3 binding; GSK461364 blocks this phosphorylation.
- The drug lost its effect in PLK1-silenced macrophages, supporting PLK1 as its functional target for NLRP3 inhibition.
- No toxicity was seen in cells (1–20 µM) or in mice given 25 mg/kg over 9 days.
Methodik
Eine Kinaseinhibitor-Bibliothek mit 429 Verbindungen wurde mittels IL-1β-ELISA in LPS-geprimten peritonealen Makrophagen der Maus gescreent, die mit Nigericin stimuliert wurden. Die Treffer wurden mit mehreren Inflammasom-Agonisten, ASC-Oligomerisierungs- und Speck-Assays sowie durch PLK1-siRNA-Knockdown validiert. Die Target Engagement wurde mittels CETSA und SPR nachgewiesen. Die Phosphorylierung von NEK7 wurde mittels Co-IP, Phos-tag, ADP-Glo und Stellenmutanten untersucht; die Wirksamkeit wurde in Mausmodellen der LPS-Endotoxämie (n=6) und der DSS-Kolitis geprüft.
Studienlimitierungen
Sämtliche Belege stammen aus Maus- und Zellmodellen mit Kurzzeitdosierung, und die Toxizitätsbewertung umfasste nur 9 Tage. Ser221/Ser260 als Phosphorylierungsstellen beruhen auf Vorhersagen und funktionellen Mutantenassays statt auf einer direkten Kartierung der Stellen, und die Ergebnisse stehen im Widerspruch zu Berichten über eine PLK1-NLRP3-Bindung und PLK4-vermittelte NEK7-Effekte. Da PLK1 eine mitotische Kinase ist, wirft eine chronische entzündungshemmende Anwendung Bedenken hinsichtlich Off-Target-Effekten und antiproliferativer Wirkungen auf, die nicht getestet wurden; zudem lässt die moderate Bindungsaffinität (KD etwa 5 µM) Raum für Off-Target-Effekte.
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