Bakterielles Enzym ApaH decappt RNA-Stresssignale durch zwei Bindungsorientierungen

<p>Dinukleosid-Tetraphosphate (Np4Ns) sind uralte, rätselhafte Moleküle, die in allen Domänen des Lebens vorkommen und deren intrazelluläre Konzentration während bakteriellen Stresses dramatisch ansteigt. Jüngste Entdeckungen zeigten, dass diese „Alarmone" als Kappen an den 5′-Enden bakterieller mRNAs und kleiner RNAs eingebaut werden können und damit zelluläre Stresssignale direkt mit der Genregulation verknüpfen. In E. coli ist das Enzym ApaH das primäre Enzym, das für die Entfernung dieser Kappen unter nicht-gestressten Bedingungen verantwortlich ist und dabei den 5′-end-abhängigen RNA-Abbau einleitet. Das Verständnis des Mechanismus von ApaH ist dringend notwendig, da seine Deletion Bakterien gegenüber Antibiotika und Stress sensibilisiert – was es zu einem vielversprechenden Ziel für Antibiotika-Potenziatoren macht.</p>

<p>Das Forschungsteam führte eine umfassende biochemische und strukturelle Untersuchung von E. coli ApaH durch und löste mehrere Röntgenkristallstrukturen: das Apo-Enzym, das Enzym gebunden an Nukleosiddiphosphat (NDP)-Produkte (ADP, GDP, CDP, UDP), das Enzym gebunden an Np4N-Substrate und das Enzym gebunden an NAD+. Sie stellten fest, dass ApaH an seinem katalytischen Kern einen binuklearen Mangan (Mn2+)-Cluster beherbergt, mit einem präzise positionierten Wassermolekül (W1), das für einen In-line-Nukleophilangriff auf das β-Phosphat des Substrats bereitsteht. Mn2+-Ionen beschleunigen die Katalyse dramatisch (~100-fach gegenüber Mg2+ allein), und eine „Triple-Fork"-Anordnung der Reste Asn65, Arg184 und Lys197 erkennt die distalen γ- und δ-Phosphate der Np4N-Substrate.</p>

<p>In biochemischen Experimenten hydrolysierte ApaH alle getesteten Np4N-Varianten (symmetrische und asymmetrische) mit ähnlichen Raten, die sich um nicht mehr als das 3-Fache unterschieden, was eine breite Substratpromiskuität demonstriert. Beim RNA-Decapping zeigte das Enzym keine signifikante Präferenz basierend auf der Anzahl der ungepaarten 5′-Nukleotide, der Nukleotididentität an der +1-Position oder der Nukleobase innerhalb der Kappe selbst. Wichtigerweise erstreckte sich diese Promiskuität auf diverse biologisch relevante Ziele: ApaH decappte effizient mehrere mRNAs und kleine RNAs (sRNAs) und beeinflusste direkt deren zelluläre Halbwertszeiten.</p>

<p>Der mechanistisch bedeutsamste Befund war, dass ApaH seine Np4N- und Np4-RNA-Substrate in zwei alternativen Orientierungen innerhalb des aktiven Zentrums binden kann. Die Strukturanalyse zeigte, dass die Nukleosid-Bindungstasche (die „Position-0"-Tasche) flach und primär aliphatisch ist und auf unspezifische CH-π-Wechselwirkungen mit Trp249 und Ser230 anstatt auf sequenzspezifische Wasserstoffbrückenbindungen angewiesen ist. Diese nahezu symmetrische Erkennung ermöglicht es Substraten, mit beiden Nukleosiden in der Bindungstasche zu docken. Molekulardynamiksimulationen unterstützten die Annahme, dass eine Orientierung moderat bevorzugt wird, beide jedoch katalytisch produktiv sind und dieselben Spaltungsprodukte (NDPs und ppRNA) erzeugen.</p>

<p>Diese Erkenntnisse haben direkte Auswirkungen auf die Wirkstoffentwicklung. Inhibitoren, die darauf ausgelegt sind, das Substrat in einer Orientierung nachzuahmen – eine gängige rationale Wirkstoffdesign-Strategie – könnten die Katalyse nicht blockieren, wenn das Enzym den Inhibitor oder das natürliche Substrat einfach in der alternativen Orientierung aufnimmt. Dieser „Orientierungs-Flucht"-Mechanismus sollte bei der Zielausrichtung auf ApaH oder strukturell ähnliche Enzyme mit pseudo-symmetrischen Substraten berücksichtigt werden. Die Studie etabliert E. coli ApaH als Prototyp für die symmetrische Klasse der Np4N-Hydrolasen und liefert den bisher detailliertesten mechanistischen Rahmen für diese Enzymfamilie.</p>