Ativador gênico TIGRa ultracompacto liga vários genes a partir de um único vetor AAV

Muitas doenças degenerativas e relacionadas ao envelhecimento, incluindo o glaucoma e outras neuropatias ópticas, provavelmente exigem mudanças coordenadas em várias vias de sobrevivência e reparo, e não a correção de um único gene. Ativadores gênicos programáveis podem aumentar a expressão dos próprios genes da célula. No entanto, os ativadores CRISPR padrão baseados em dSpCas9 (1368 aminoácidos) são grandes demais para um único vetor AAV, que comporta cerca de 4,7 kb. Ativadores maiores, portanto, exigem a entrega por dois vetores, e as alternativas compactas até agora não ofereceram multiplexação escalável.

A equipe de Stanford testou oito miniproteínas guiadas por RNA, com nuclease inativa (337-506 aminoácidos), fusionadas ao domínio de ativação VPR, tendo como alvo o promotor de HBB em células HEK293T. Somente a ParTasR inativa, da família TIGR-TasR, produziu ativação robusta (até 7486 vezes, contra 8676 vezes do controle dCasMINI-VPR). Ela deu origem ao TIGRa. O sistema usa um tigRNA curto, de 36 nt, não tem exigência rigorosa de PAM e prefere um alvo de 18 nt com cerca de 50-67% de conteúdo de GC. Ele ativou 20 de 24 sítios testados em HBB, 10 deles em mais de 100 vezes, e também funcionou em ASCL1, IL1RN e HBG1. Em quatro loci, o TIGRa atingiu cerca de 0,74 da atividade do dSpCas9 e superou os ativadores dCasMINI, dCas12a e hyperdCas12a por 2,45 a 3,55 vezes.

Em seguida, a equipe substituiu os domínios de ativação por versões menores e acrescentou domínios auxiliares de ligação ao DNA. O TIGRa-Mini (domínio NFZ, 540 aa) tem cerca de um quarto do tamanho do dSpCas9 e manteve atividade próxima à original, de cerca de 0,72 vez. O TIGRa-Pro (NFZ mais p65, 727 aa) foi cerca de 2,3 vezes mais ativo que o TIGRa. O TIGRa-Ultra (com adição do domínio de ligação ao DNA Aho7c) foi cerca de 4 vezes mais ativo. O RNA-seq de todo o transcriptoma mostrou que todas as variantes aumentaram seletivamente o alvo pretendido, HBB, com perfis de efeitos fora do alvo em geral comparáveis aos do dCasMINI-VPR, de alta especificidade.

Para a multiplexação, um arranjo nativo de quatro tigRNAs de 36 nt (414 pb) igualou, em ativação (1,16 vez), o desenho convencional com quatro promotores U6 (1224 pb) e superou os desenhos processados por ribozimas. O RNA-seq de pequenos RNAs mostrou que as células de mamíferos processam o arranjo em tigRNAs individuais. O resumo (o texto completo fornecido é interrompido neste ponto) relata que isso permitiu a ativação simultânea de até 12 genes endógenos a partir de uma única construção compacta, a reprogramação eficiente de fibroblastos humanos em células-tronco pluripotentes induzidas e a ativação in vivo da CaMKII endógena por um vetor AAV-TIGRa tudo-em-um. Em um modelo de lesão retiniana induzida por NMDA em camundongos, isso favoreceu a sobrevivência das células ganglionares da retina e preservou a função visual.

Se esses resultados se confirmarem, o TIGRa poderá ser uma via prática para a regulação terapêutica de múltiplos genes com entrega por vetor único. Entre as ressalvas está o contexto pré-clínico: a maior parte da caracterização usou células HEK293T e um único modelo de lesão aguda em camundongos. A ativação ainda varia conforme o sítio-alvo, e a segurança a longo prazo, a imunogenicidade e a especificidade em tecidos humanos relevantes continuam não testadas. Os detalhes dos experimentos in vivo e de reprogramação não estavam disponíveis no texto fornecido.