O Enriquecimento por Captura com Sonda Alcança 100% de Recuperação do Genoma Completo do RSV

O vírus sincicial respiratório (RSV) e o norovírus humano (HuNoV) representam, em conjunto, dois dos patógenos virais de maior impacto global — o RSV como principal causa de doença respiratória grave do trato inferior em lactentes e idosos, e o HuNoV como o principal agente de gastroenterite aguda no mundo. Apesar de sua importância clínica, a obtenção de sequências genômicas completas e de alta qualidade a partir de amostras clínicas permanece difícil devido aos baixos títulos virais, ao elevado ruído de fundo do hospedeiro e à extraordinária diversidade genética entre subtipos e genótipos. Os painéis comerciais de enriquecimento existentes são projetados para a detecção viral ampla, e não para a recuperação profunda e completa do genoma desses patógenos específicos.

Para suprir essa lacuna, a equipe do Baylor College of Medicine desenvolveu conjuntos de sondas oligonucleotídicas direcionadas a partir da mineração de 1.570 sequências de RSV e 1.376 de HuNoV depositadas no GenBank, garantindo cobertura de todos os principais subtipos e genótipos. Para o RSV, o conjunto de sondas foi concebido para capturar os subtipos RSV-A e RSV-B, incluindo os genótipos ON e BA atualmente predominantes. Para o HuNoV, as sondas foram direcionadas aos genótipos GI.1, GII.4, GII.3, GII.6 e GII.17. As bibliotecas foram preparadas a partir de RNA extraído de swabs nasais de turbinado médio (RSV) e amostras de fezes ou enteroides intestinais humanos (HuNoV), convertido em cDNA, com adição de barcodes, agrupadas por valor de Ct e sequenciadas na plataforma Illumina NovaSeq 6000 em modo 2×150 bp.

O desempenho do enriquecimento foi notável. Para o RSV, o percentual de reads mapeadas no genoma viral aumentou de 0,08% antes da captura para 85,1% após a captura — um enriquecimento superior a 1.000 vezes. A cobertura média do genoma passou de apenas 6× antes da captura para 123.524× após a captura (mediana). Para o HuNoV, as reads virais aumentaram de 1,15% para 40,8%, com a cobertura média passando de 2.285× para 241.333×. De forma crítica, genomas completos (definidos como >90% de completude, intervalo de comprimento correto e cobertura >20×) foram recuperados em 100% de 85 amostras de RSV após a captura, em comparação com apenas 4% (1/24) antes da captura. Para o HuNoV, genomas completos foram obtidos em 85% (47/55) das amostras após a captura, versus 33% (18/55) antes da captura. Mesmo amostras com valores de Ct de até 34,8 — próximos ou abaixo do limite de detecção — produziram genomas completos ou quase completos após o enriquecimento.

As análises filogenéticas e de genotipagem confirmaram a atribuição precisa de subtipo e genótipo para todos os genomas montados com sucesso, consistente com a tipagem prévia por qPCR. As amostras de RSV-A agruparam-se dentro do genótipo ON e as de RSV-B dentro do genótipo BA, conforme esperado para as cepas em circulação contemporânea. A genotipagem do HuNoV resolveu corretamente os genótipos GI.1, GII.4 e outros genótipos GII. Um achado particularmente inédito foi a caracterização dos padrões do transcriptoma de mRNA subgenômico (sgmRNA) do RSV diretamente a partir de dados clínicos de captura-enriquecimento — a primeira demonstração desse tipo a partir de espécimes de pacientes —, revelando níveis de expressão diferencial entre os 10 genes do RSV.

O estudo tem implicações importantes para a vigilância genômica viral, o desenvolvimento de vacinas e o monitoramento de resistência a antivirais. A capacidade de recuperar genomas de comprimento total a partir de amostras clínicas de baixo título, sem abordagens baseadas em amplicons, elimina o viés de ligação de primers e permite a detecção não tendenciosa de novas variantes. O fluxo de trabalho é escalável e compatível com a infraestrutura Illumina padrão. As limitações incluem o conjunto de amostras relativamente pequeno, a ausência de amostras com valores de Ct acima de 35 para avaliação sistemática e o fato de que 8 das 55 amostras de HuNoV ainda não produziram genomas completos após a captura, provavelmente devido a cargas virais extremamente baixas ou RNA degradado.