Cryo-ET Revela Como as Mitocôndrias São Desmontadas e Engolfadas na Via do Parkinson

Parkinson's disease está geneticamente ligada a defeitos no controle de qualidade mitocondrial, particularmente por meio de mutações em <i>PINK1</i> e <i>PRKN</i> (Parkin). Quando as mitocôndrias perdem seu potencial de membrana, PINK1 se acumula na membrana mitocondrial externa, recruta e ativa Parkin, e a organela danificada é, por fim, eliminada pela mitofagia. Apesar de décadas de trabalho bioquímico, as precisas alterações estruturais em nanoescala que ocorrem durante esse processo no interior de células intactas nunca haviam sido visualizadas diretamente — até agora.

A equipe de pesquisa desenvolveu células de osteossarcoma U2OS expressando Parkin e co-expressando repórteres fluorescentes para mitocôndrias e Parkin, que foram então tratadas com oligomicina e antimicina A (OA) para colapsar seletivamente o potencial de membrana mitocondrial. A microscopia cryo-fluorescência guiou o processo de fresagem cryo-FIB, produzindo lamelas de ~200 nm a partir de células vitrificadas para cryo-ET. No total, 92 lamelas e 157 tomogramas foram reconstruídos, fornecendo um conjunto de dados estruturais in situ sem precedentes de mitocôndrias despolarizadas.

Diversas consequências estruturais marcantes da despolarização foram documentadas. As mitocôndrias fragmentaram-se de um diâmetro médio de ~1,3 µm para ~0,7 µm. As cristas tornaram-se mais esparsas e, em algumas mitocôndrias, vesículas delimitadas por membrana substituíram o interior lamelar normal. Aglomerados de fosfato de cálcio — normalmente abundantes na matriz — estavam completamente ausentes após o tratamento com OA. Uma subpopulação de complexos F0F1 ATP sintase, normalmente confinada às cristas, foi encontrada deslocalizada para a membrana de contorno interno (IBM), a região plana da membrana interna aposta à membrana externa. Cerca de 17% dos fragmentos mitocondriais foram visivelmente direcionados por estruturas de dupla membrana semelhantes a fagóforos, com alguns capturados em estágios iniciais, intermediários e tardios (totalmente envolvidos). De forma crucial, densidades em forma de bastão consistentes com ATG2A/BLTP foram identificadas formando pontes entre as membranas do fagóforo e membranas doadoras adjacentes, fornecendo evidências estruturais diretas in celula para a transferência de lipídeos durante a expansão do fagóforo.

Talvez a descoberta estrutural mais inovadora tenha envolvido o complexo proibitina, um arcabouço dodecamérico (seis dímeros PHB1-PHB2) localizado no IMS sobre a membrana mitocondrial interna. A média de subtomogramas resolveu o complexo tanto em células não tratadas quanto em células tratadas com OA com resolução suficiente para distinguir dois estados conformacionais — uma forma aberta e expandida e uma cúpula fechada e compacta. O tratamento com OA enriqueceu significativamente a conformação fechada, sugerindo que a proibitina sofre uma mudança conformacional funcionalmente relevante em resposta ao estresse mitocondrial — uma descoberta com potenciais implicações para a regulação da arquitetura das cristas e da organização proteica durante a mitofagia.

Esses dados estabelecem, em conjunto, uma linha de base estrutural em nanoescala para a mitofagia mediada por PINK1-Parkin em células humanas. Eles demonstram o poder da cryo-CLEM correlativa e da cryo-ET para capturar eventos transitórios de remodelação mitocondrial in situ e fornecem uma estrutura para estudos futuros que dissecam a maquinaria molecular precisa da autofagia seletiva no contexto da neurodegeneração.