Cryo-EM Revela Como os Canais Kir4.1/5.1 Bloqueiam o Fluxo de Potássio

Os canais de potássio de retificação interna (Kir) regulam o potencial de membrana e a homeostase do potássio no coração, cérebro, rins e ouvido interno. Entre eles, o canal heteromérico Kir4.1/5.1 — formado pelos produtos dos genes <i>KCNJ10</i> e <i>KCNJ16</i> — é particularmente importante: mutações em <i>KCNJ10</i> causam a síndrome EAST/SeSAME (epilepsia, ataxia, perda auditiva neurossensorial e tubulopatia renal), e a inibição farmacológica do Kir4.1/5.1 produz diurese e efeitos antidepressivos em modelos animais. Apesar de décadas de trabalhos em eletrofisiologia e mutagênese, o mecanismo em nível atômico pelo qual poliaminas como a espermina bloqueiam esses canais para produzir retificação interna permanecia sem resolução.

A equipe de pesquisa expressou construções truncadas, porém funcionalmente validadas, de Kir4.1 (resíduos 25–368) e Kir5.1 (resíduos 20–355), confirmou que suas propriedades eletrofisiológicas correspondiam às dos canais de comprimento total e os purificou em micelas do detergente glico-diosgenina (GDN) sem PIP2. Por meio de cryo-EM de partícula única, determinaram quatro estruturas: o canal apo e complexos com espermina, VU0134992 e EHop-016, todas com resolução entre 3,1 e 3,5 Å. O canal se organiza como um heterotetrâmero 2:2 em arranjo alternado (oposto) — e não na ordem 4-5-4-5 anteriormente assumida —, medindo aproximadamente 115 × 65 × 70 Å, com um domínio transmembrana conservado e um domínio citoplasmático rico em folhas beta.

A descoberta mais marcante é um mecanismo de 'bloqueio em anel interno'. Em vez de se orientar linearmente ao longo do eixo do poro, como se havia hipotetizado anteriormente, a espermina (duas moléculas), o VU0134992 (duas moléculas) e o EHop-016 (uma molécula) adotam uma orientação paralela à membrana no sítio superior da cavidade central transmembrana. Eles formam uma barreira em forma de anel que oclui o fluxo iônico. O resíduo ácido-chave E158 no Kir4.1 (o 'controlador de retificação') coordena esses ligantes, explicando por que a mutação desse resíduo elimina a retificação forte. Os dados estruturais são corroborados por eletrofisiologia e simulações de dinâmica molecular, que confirmam que a ocupação do bloqueador nesse sítio impede a corrente de K+ para fora da célula.

O EHop-016, anteriormente conhecido apenas como inibidor da Rac GTPase com propriedades anticâncer, foi aqui identificado pela primeira vez como um potente inibidor do canal Kir, com valores de IC50 de 0,80 ± 0,05 μM para Kir4.1 e 3,20 ± 0,18 μM para Kir4.1/5.1. Sua ocupação de molécula única no sítio do anel interno contrasta com a ligação de duas moléculas da espermina e do VU0134992, ilustrando como a geometria molecular determina a estequiometria do bloqueio. As duas interfaces distintas da subunidade citoplasmática (Kir4/5 canônica e Kir5/4 atípica) também diferem estruturalmente e provavelmente explicam a sensibilidade ao pH exclusiva do heterômero e sua retificação mais intensa em comparação ao Kir4.1 homomérico.

Essas estruturas estabelecem um arcabouço unificado para a compreensão da farmacologia dos canais Kir e fornecem um modelo para o design racional de fármacos que têm como alvo o Kir4.1/5.1 em doenças neurológicas, cardiovasculares e renais.