Edição de bases em embriões humanos silencia o PCSK9 com eficiência quase perfeita
Cientistas da Columbia alcançaram 100% de edição de alelos do gene *PCSK9* em embriões humanos usando editores de bases, abrindo caminho para a redução hereditária do LDL — mas ainda há obstáculos de segurança a superar.
Resumo
Quebras de DNA induzidas por Cas9 em embriões humanos podem causar grandes deleções e contagens cromossômicas anormais. Os pesquisadores testaram editores de bases de adenina direcionados a PCSK9 e HBG1/2. A proteína ABE8e(V106W), administrada na fertilização, editou todos os 32 alelos de PCSK9 examinados em cinco embriões. A administração da proteína permitiu o desenvolvimento até blastocisto, e não foram observadas inserções nem deleções pequenas ou grandes após a edição de bases. No entanto, ocorreram quebras cromossômicas raras no local-alvo, anormalidades cromossômicas e edições não intencionais em mosaico. A ABE8.8-m, administrada como mRNA, causou parada precoce frequente do desenvolvimento embrionário. Os autores concluem que as lesões causadas pelos editores de bases são reparadas com eficiência, mas os riscos genômicos e de desenvolvimento remanescentes atualmente impedem o uso clínico reprodutivo.
Resumo Detalhado
As quebras de fita dupla de DNA induzidas pela Cas9 são mal reparadas em embriões humanos e podem causar grandes deleções e anormalidades cromossômicas. Os editores de bases de adenina, por outro lado, introduzem cortes em uma única fita e alterações de bases. Este estudo examinou os resultados do reparo e o desenvolvimento inicial após a edição de PCSK9 e dos promotores de HBG1/2 em embriões humanos. O PCSK9 foi alvo de uma edição destinada a interromper sua função; a edição de HBG1/2 corresponde a uma variante associada à expressão contínua de hemoglobina fetal na vida adulta.
Os pesquisadores administraram ABE8.8-m como mRNA, e ABEmax e ABE8e(V106W) como complexos de proteína e RNA guia. As injeções foram realizadas em zigotos com dois pró-núcleos ou em oócitos em metáfase II no momento da fertilização. A edição foi avaliada por sequenciamento de Sanger, com sequenciamento de nova geração também utilizado na análise de HBG.
A proteína ABEmax administrada no estágio de dois pró-núcleos produziu edições homozigotas de PCSK9 em 47 de 77 blastômeros (61%); o mRNA de ABE8.8-m produziu edições homozigotas em 42 de 64 células (66%). A proteína ABE8e(V106W) administrada na fertilização editou todos os 32 alelos-alvo examinados em células e pró-núcleos de cinco embriões. O resumo também relata a obtenção de linhagens de células-tronco editadas homozigotas.
O formato de administração afetou o desenvolvimento. Dos 44 embriões injetados com mRNA de ABE8.8-m, 38 (86%) pararam de se desenvolver entre os estágios de uma a quatro células, e dois chegaram a blastocisto. Um editor inativo melhorou significativamente o desenvolvimento em comparação com o editor ativo (P=0,0081, teste de Kruskal–Wallis). A interrupção do desenvolvimento também ocorreu sem RNA guia, o que sugere atividade da desaminase independente do guia. Com os complexos de proteína e RNA guia de ABEmax ou ABE8e(V106W), o desenvolvimento até blastocisto foi semelhante ao dos controles, e não se observou parada precoce do desenvolvimento em nenhum dos dois estágios de injeção.
Não foram observadas inserções nem deleções pequenas ou grandes após a edição de bases. Ainda assim, ocorreram, raramente, quebras cromossômicas no alvo e anormalidades cromossômicas, e a edição de bases adjacentes (bystander) e fora do alvo foi em mosaico. Assim, o sucesso da edição do alvo e o desenvolvimento até blastocisto não estabeleceram a segurança genômica.
Os autores concluem que as lesões induzidas por editores de bases são reparadas com eficiência em comparação com as quebras de DNA induzidas pela Cas9, mas os efeitos adversos genômicos e de desenvolvimento atualmente impedem o uso clínico na reprodução. Estes são achados de embriões em laboratório, e não evidência de gravidez segura, de filhos saudáveis ou de prevenção clínica de doenças.
Principais Descobertas
- ABE8e(V106W) protein delivered at fertilization edited all 32 PCSK9 target alleles examined in cells and pronuclei from 5 human embryos
- ABE8.8-m mRNA arrested 38 of 44 embryos (86%) at the one-to-four-cell stage; 2 reached blastocysts, and an inactive editor improved development (P=0.0081)
- No insertions or small or large deletions were observed after base editing, but rare on-target chromosome breakages and chromosomal abnormalities occurred
- ABEmax and ABE8e(V106W) protein–guide complexes supported blastocyst development similar to controls, with no early arrest observed at either injection stage
- The researchers derived homozygous edited stem cell lines, as reported in the abstract
- Bystander and off-target editing was mosaic, leaving genomic risks despite efficient intended editing
- Arrest also occurred when ABE8.8-m mRNA was delivered without guide RNA, implicating guide-independent deaminase activity
Metodologia
Zigotos humanos com dois pronúcleos e oócitos em metáfase II no momento da fertilização receberam editores de base de adenina direcionados ao *PCSK9* e/ou ao *HBG1/2*. O ABE8.8-m foi administrado na forma de mRNA; o ABEmax e o ABE8e(V106W) foram administrados como complexos proteína–RNA guia. O texto fornecido descreve o sequenciamento de Sanger de blastômeros e pronúcleos, o sequenciamento de nova geração para a análise do *HBG*, o acompanhamento do desenvolvimento até o sexto dia e controles com microinjeção simulada (mock) e com editor inativo. A comparação entre mRNA ativo e inativo utilizou o teste de Kruskal–Wallis. O resumo também relata a obtenção de linhagens de células-tronco homozigotas editadas.
Limitações do Estudo
O resultado completo da edição de *PCSK9* baseou-se em 32 alelos examinados em cinco embriões e não deve ser generalizado para todos os embriões ou protocolos de edição. O desenvolvimento até o estágio de blastocisto não estabelece segurança desenvolvimental ou reprodutiva posterior. Permaneceram anormalidades cromossômicas raras, além de edição mosaico em sítios adjacentes (bystander) e edição fora do alvo (off-target). Os experimentos de interrupção do desenvolvimento associados ao mRNA implicaram atividade de desaminase independente do guia. O trecho fornecido termina no meio de uma frase e não corrobora os detalhes adicionais dos ensaios, os resultados quantitativos de edição fora do alvo nem as limitações da comparação entre métodos de entrega incluídos no resumo original.
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