Las moléculas pequeñas por sí solas pueden reprogramar rápidamente las células hacia la pluripotencia: así funciona

Convertir células maduras de nuevo en células madre pluripotentes es una piedra angular de la medicina regenerativa y de la investigación sobre rejuvenecimiento. La mayoría de los métodos se basan en factores de transcripción administrados mediante genes. Este equipo había construido previamente un sistema de reprogramación química rápida (FCR, por sus siglas en inglés) que genera células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en un plazo de 7 a 12 días utilizando únicamente moléculas pequeñas, pero la biología subyacente se comprendía poco. Este estudio se pregunta cómo el control postranscripcional, en concreto el splicing alternativo (AS), da forma a ese proceso.

Los autores compararon primero la expresión de proteínas de unión al RNA (RBP) y el splicing en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), iPSC inducidas químicamente (fiPSC) y células madre embrionarias. Los genes del espliceosoma fueron la categoría de RBP más enriquecida. Los perfiles de splicing de las fiPSC se agruparon con los de las células madre embrionarias y se separaron de los de los MEF. Unos 1000 exones omitidos (skipped exons) diferían entre los MEF y las fiPSC. Los exones preferidos en los MEF eran más cortos (mediana de 86 frente a 104,5 pb) y tenían intrones flanqueantes más largos (4358 frente a 3409 pb). Así, las moléculas pequeñas por sí solas reconfiguraron el panorama del splicing.

Un cribado con shRNA de RBP relacionadas con el espliceosoma identificó a PTBP3 como regulador negativo. Su silenciamiento (knockdown) duplicó aproximadamente el número de colonias de fiPSC sin modificar el número de células. Un segundo shRNA reprodujo este resultado, y el rescate con un Ptbp3 resistente al shRNA lo revirtió. La sobreexpresión suprimió las colonias y la inducción de Oct4 y Dppa5a. El silenciamiento del gen relacionado Ptbp1 tuvo un efecto mínimo. El silenciamiento de Ptbp3 también favoreció a los fibroblastos pulmonares de ratón adulto, pero no la reprogramación con factores de transcripción. El inhibidor de TGF-β 616452 indujo Ptbp3, y el silenciamiento de Smad2 aumentó la expresión de Ptbp3. Las fiPSC con silenciamiento en el pase 12 expresaban OCT4, SOX2 y NANOG y formaron las tres capas germinales.

La RNA-seq masiva (bulk) en el día 8 halló 421 genes codificantes de proteínas con expresión aumentada y 630 con expresión reducida tras el silenciamiento, y 319 de ellos coincidían con datos publicados de unión de PTBP3. Disminuyeron los términos de respuesta inflamatoria y de actividad de NF-kB. El RNA nucleolar pequeño Rian, vinculado al potencial de desarrollo de las iPSC, aumentó, y el regulador negativo de la reprogramación MMVL30-int disminuyó. La RNA-seq de célula única de 21 995 células mostró más intermediarios e iPSC incipientes tras el silenciamiento, activación de las vías de lisosoma, autofagia, mTOR, proteasoma y regulación de la longevidad, y una menor variabilidad, con una caída del factor de Fano en más del 95 % de los genes.

El análisis de splicing encontró cambios en unos 600 eventos de exón casete, 800 de retención de intrones, 200 de Alt5 y 200 de Alt3. Los exones casete cercanos a motivos de unión de PTBP3 implicaron vías de las proteínas polycomb, y 93 de 211 genes con exones casete tenían evidencia de unión directa. Scmh1, un componente de PRC1, cambió su equilibrio de isoformas. Según el resumen del artículo, el eje PTBP3-SCMH1 regula el depósito de H2AK119ub en genes inflamatorios, y los inhibidores amlexanox y BMS-345541 mejoraron aún más la eficiencia de la FCR.

Las implicaciones son principalmente mecanísticas. La reprogramación química activa sus propios frenos, y la inflamación y el control del splicing pueden modularse. Salvedades: todo el trabajo se realizó con células de ratón y shRNA, sin células humanas ni rejuvenecimiento in vivo. Algunas secciones posteriores del artículo no estaban disponibles para este resumen.