Vesículas Musculares Neonatales Cargadas con miR-542-3p Revierten el Envejecimiento del Músculo Esquelético en Ratones

Sarcopenia — la pérdida progresiva de masa y fuerza muscular esquelética asociada al envejecimiento — es uno de los rasgos distintivos más determinantes del envejecimiento humano, y constituye un factor clave en la fragilidad, las caídas y la pérdida de independencia. Las intervenciones actuales (entrenamiento de resistencia, suplementación proteica y agentes farmacológicos) presentan limitaciones propias, lo que impulsa la búsqueda de terapias biológicas libres de células. Este estudio presenta las vesículas extracelulares derivadas de músculo neonatal (NMEVs, por sus siglas en inglés) como una fuente hasta ahora inexplorada de señales rejuvenecedoras, administradas mediante un innovador sistema de parche de microagujas (MN).

Las vesículas extracelulares se aislaron de los músculos gastrocnemios de ratones neonatales de 2 días de vida (NMEVs) y de ratones adultos de 3 meses (AMEVs) mediante ultracentrifugación diferencial a 120.000g durante 2 horas, seguida de análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión para su caracterización. Ambas preparaciones confirmaron la presencia de marcadores canónicos de vesículas extracelulares (TSG101, CD9 y CD81 positivos; Calnexin negativo), con un diámetro promedio de las NMEVs de aproximadamente 100–150 nm. En miobastos C2C12 senescentes inducidos por ácido palmítico (PA, 200 µM), las NMEVs a 100 µg/mL superaron significativamente a las AMEVs en todos los parámetros evaluados: las NMEVs redujeron la actividad de la SA-β-galactosidasa, disminuyeron los niveles proteicos de p21 y p16, restauraron el potencial de membrana mitocondrial, redujeron las especies reactivas de oxígeno, mejoraron el número de copias de DNA mitocondrial y disminuyeron la acumulación de gotas lipídicas, mientras que las AMEVs a la misma dosis produjeron únicamente mejoras modestas.

Para superar la barrera de administración —las vesículas extracelulares libres son eliminadas rápidamente antes de alcanzar el tejido muscular profundo—, el equipo desarrolló un parche de microagujas (MN) bicapa denominado NMEVs@PLGA@Fucoidan-HA MN. Las NMEVs se encapsularon primero en microesferas de PLGA (diámetro medio de ~2–5 µm), que posteriormente se incorporaron a una capa de punta de hidrogel de fucoidán-ácido hialurónico (HA), con una capa de soporte de polivinilpirrolidona (PVP) que proporcionaba rigidez mecánica. El recubrimiento de fucoidán fue seleccionado por sus propiedades antiinflamatorias y su afinidad de direccionamiento hacia CD44 a través del HA. La matriz de microagujas penetró la piel hasta aproximadamente 600 µm, se disolvió en unos 5 minutos al contacto con el fluido intersticial y liberó microesferas de PLGA que permitieron una administración sostenida de NMEVs durante varios días. Las imágenes de fluorescencia confirmaron la penetración de la punta de las agujas en el tejido dérmico y la internalización de vesículas extracelulares marcadas con PKH67 en células C2C12 a las 24 horas.

En ratones envejecidos de 20 meses tratados durante cuatro semanas con el parche MN aplicado en el miembro posterior sobre el gastrocnemio, el NMEVs@PLGA@Fucoidan-HA MN aumentó significativamente el área de sección transversal (CSA) de las fibras musculares, mejoró la fuerza de agarre, redujo el área de fibrosis positiva al tricrómico de Masson, disminuyó los depósitos lipídicos teñidos con Oil Red O y redujo la expresión de los marcadores de senescencia p21/p16 en comparación tanto con los controles envejecidos no tratados como con el grupo que recibió inyección de NMEVs libres. La función mitocondrial mejoró, tal como evidenciaron el aumento de la producción de ATP, la elevación del potencial de membrana mitocondrial (ensayo JC-1), el mayor número de copias de mtDNA y la restauración de la expresión de las subunidades del complejo de fosforilación oxidativa.

En cuanto al mecanismo, la secuenciación de miRNA reveló que miR-542-3p se encontraba entre los miRNAs más enriquecidos en las NMEVs en comparación con las AMEVs. Los ensayos de reportero de luciferasa confirmaron la unión directa al 3′-UTR de miR-542-3p tanto a Eef1a1 (factor de elongación de la traducción eucariota 1 alfa 1) como a Asxl2 (additional sex combs-like 2). El silenciamiento de Eef1a1 activó la vía de señalización AMPK (aumento de fosfo-AMPK y fosfo-ACC), lo que mejoró la biogénesis mitocondrial y redujo los marcadores de senescencia. De forma independiente, el silenciamiento de Asxl2 redujo los niveles proteicos de PPARγ, suprimiendo así la formación de gotas lipídicas en miobastos sometidos a estrés por PA. Los experimentos de rescate por sobreexpresión confirmaron que la restauración de Eef1a1 o Asxl2 atenuaba los efectos protectores de la transfección con el mimético de miR-542-3p, lo que valida el mecanismo de doble diana. Un inhibidor de miR-542-3p atenuó los efectos antienvejecimiento de las NMEVs in vitro, confirmando su papel central.

Este estudio es preclínico y se realizó exclusivamente en ratones, por lo que la traslación a la terapia de la sarcopenia humana requiere una validación adicional. La vía de administración mediante MN es novedosa para aplicaciones de direccionamiento muscular y muestra potencial para el acceso transdérmico a músculos superficiales; no obstante, la profundidad de penetración en grupos musculares más profundos en humanos representaría un desafío de ingeniería considerable. El estudio aporta una prueba de concepto de que una preparación de vesículas extracelulares obtenida de tejido neonatal, enriquecida en un miRNA funcionalmente potente y administrada mediante una plataforma de biomaterial diseñada, puede abordar simultáneamente la disfunción mitocondrial, la senescencia celular, la fibrosis y la disregulación lipídica en el músculo esquelético envejecido.