Fármaco contra el cáncer GSK461364 frena la inflamación mediada por el inflamasoma NLRP3 en ratones
Un compuesto contra el cáncer que inhibe PLK1 bloquea el ensamblaje del inflamasoma NLRP3 al impedir la fosforilación de NEK7, lo que alivia la endotoxemia y la colitis en ratones.
Resumen
Los inflamasomas NLRP3 hiperactivos están detrás de muchas enfermedades inflamatorias, pero la mayoría de los fármacos dirigidos contra NLRP3 se han estancado en el desarrollo clínico. Los investigadores analizaron 429 inhibidores de cinasas en macrófagos de ratón y descubrieron que GSK461364, un inhibidor de PLK1 que ya se había probado en ensayos oncológicos, bloqueaba con fuerza la liberación de IL-1β dependiente de NLRP3. No afectó a los inflamasomas AIM2 ni NLRC4. En ratones, redujo la inflamación en la endotoxemia inducida por LPS y en la colitis inducida por DSS, sin toxicidad visible durante 9 días. En cuanto al mecanismo, parece que PLK1 fosforila NEK7, probablemente en Ser221 y Ser260, lo que refuerza la unión entre NEK7 y NLRP3 necesaria para el ensamblaje del inflamasoma. Bloquear PLK1 reduce esta fosforilación y la activación del inflamasoma. El trabajo es preclínico, pero sugiere la posibilidad de reutilizar los inhibidores de PLK1 para tratar la inflamación impulsada por NLRP3.
Resumen detallado
El inflamasoma NLRP3 es un complejo proteico que desencadena la activación de la caspasa-1, la liberación de IL-1β y la muerte celular piroptótica. Su sobreactivación se asocia con colitis, gota, aterosclerosis, sepsis y diabetes tipo 2, todas ellas relevantes para el inflammaging. Muchos inhibidores directos de NLRP3, como MCC950, han fracasado en la clínica, por lo que se necesitan nuevas dianas y fármacos.
El equipo examinó una biblioteca de 429 inhibidores de cinasas en macrófagos peritoneales de ratón cebados con LPS y estimulados con nigericina, añadiendo los compuestos después del cebado para evitar efectos sobre esa etapa. Seis compuestos redujeron la IL-1β sin disminuir el TNF-α, entre ellos cuatro con actividad supresora de NLRP3 descrita previamente, lo que validó el cribado. El sexto, GSK461364, un inhibidor de PLK1, era nuevo. A 10 µM bloqueó la liberación de IL-1β, la liberación de LDH (muerte celular), la escisión de la caspasa-1 y la oligomerización de ASC y la formación de specks tras ATP, nigericina o MSU. Tuvo escaso efecto sobre los inflamasomas AIM2 o NLRC4, lo que apunta a selectividad por NLRP3.
In vivo, GSK461364 administrado por vía intraperitoneal (10 y 25 mg/kg) redujo la IL-1β sérica, pero no el TNF-α ni la IL-6, en la endotoxemia por LPS. También disminuyó la inflamación pulmonar y la escisión de GSDMD y de la caspasa-1. En la colitis por DSS, redujo la pérdida de peso, las puntuaciones de actividad de la enfermedad, el acortamiento del colon, el daño tisular y la oligomerización de ASC en el colon. Una dosis de 25 mg/kg durante 9 días no produjo cambios en el peso corporal, los marcadores hepáticos o renales ni la histología de los órganos, y no apareció citotoxicidad en células cultivadas a 1–20 µM.
El fármaco no alteró el daño mitocondrial, las ROS mitocondriales, el flujo de salida de potasio o cloruro, ni la expresión de los componentes del inflamasoma. GSK461364 se unió a PLK1 (KD por SPR de aproximadamente 5,21 µM), el silenciamiento de PLK1 imitó sus efectos y el fármaco perdió actividad en células con PLK1 silenciada. PLK1 interactuó con NEK7, pero no con NLRP3. La disminución o inhibición de PLK1 redujo la fosforilación en Ser/Thr de NEK7 inducida por nigericina y debilitó la asociación NEK7-NLRP3. Los ensayos de cinasa in vitro (Phos-tag, ADP-Glo) mostraron una fosforilación directa de NEK7 por PLK1, que GSK461364 redujo. Los mutantes NEK7 S221A y S260A deterioraron la producción de IL-1β en células HEK293T reconstituidas.
Los hallazgos describen un eje PLK1/NEK7/NLRP3 y respaldan el reposicionamiento de los inhibidores de PLK1 para la inflamación. Las salvedades son importantes: los datos proceden de modelos en ratones y células, los sitios de fosforilación se describen como «probables» (basados en mutaciones y predicciones, no confirmados por espectrometría de masas), y la inhibición de PLK1 tiene efectos antimitóticos que podrían limitar su uso crónico. El trabajo también contradice otros informes sobre el papel de PLK1 y PLK4 en la regulación de NLRP3.
Hallazgos clave
- Screening 429 kinase inhibitors identified GSK461364, a PLK1 inhibitor, as a selective NLRP3 inflammasome blocker with little effect on AIM2 or NLRC4.
- GSK461364 reduced serum IL-1β, lung inflammation and GSDMD/caspase-1 cleavage in LPS endotoxemia, and eased DSS colitis in mice.
- PLK1 phosphorylates NEK7, likely at Ser221 and Ser260, enhancing NEK7-NLRP3 binding; GSK461364 blocks this phosphorylation.
- The drug lost its effect in PLK1-silenced macrophages, supporting PLK1 as its functional target for NLRP3 inhibition.
- No toxicity was seen in cells (1–20 µM) or in mice given 25 mg/kg over 9 days.
Metodología
Se cribó una biblioteca de 429 compuestos inhibidores de cinasas mediante ELISA de IL-1β en macrófagos peritoneales de ratón cebados con LPS y estimulados con nigericina. Los hallazgos se validaron con múltiples agonistas del inflamasoma, ensayos de oligomerización de ASC y de formación de specks, y silenciamiento de PLK1 mediante siRNA. La unión al blanco terapéutico se demostró mediante CETSA y SPR. La fosforilación de NEK7 se evaluó mediante co-IP, Phos-tag, ADP-Glo y mutantes de sitio, y la eficacia se puso a prueba en modelos murinos de endotoxemia por LPS (n=6) y de colitis inducida por DSS.
Limitaciones del estudio
Toda la evidencia procede de modelos en ratones y en células con dosificación a corto plazo, y la evaluación de toxicidad abarcó solo 9 días. La identificación de Ser221/Ser260 como sitios de fosforilación se basa en predicciones y en ensayos funcionales con mutantes, y no en un mapeo directo de los sitios; además, los hallazgos contradicen los informes sobre la unión de PLK1 con NLRP3 y sobre los efectos de NEK7 mediados por PLK4. Dado que PLK1 es una cinasa mitótica, el uso antiinflamatorio crónico plantea preocupaciones de efectos fuera de la diana y antiproliferativos que no se evaluaron, y la afinidad de unión moderada (KD de aproximadamente 5 µM) deja margen para efectos fuera de la diana.
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