La edición de bases en embriones humanos silencia PCSK9 con una eficiencia casi perfecta
Científicos de Columbia lograron una edición alélica del 100 % de *PCSK9* en embriones humanos mediante editores de bases, lo que abre un camino hacia una reducción hereditaria del LDL, aunque persisten obstáculos de seguridad.
Resumen
Las roturas del ADN inducidas por Cas9 en embriones humanos pueden causar grandes deleciones y un número anormal de cromosomas. Los investigadores probaron editores de bases de adenina dirigidos a PCSK9 y HBG1/2. La proteína ABE8e(V106W), administrada en el momento de la fecundación, editó los 32 alelos de PCSK9 examinados en cinco embriones. La administración como proteína permitió el desarrollo hasta blastocisto, y tras la edición de bases no se observaron inserciones ni deleciones pequeñas o grandes. Sin embargo, se produjeron roturas cromosómicas poco frecuentes en el sitio diana, anomalías cromosómicas y edición no deseada en mosaico. ABE8.8-m, administrado como mRNA, provocó con frecuencia la detención temprana del desarrollo embrionario. Los autores concluyen que las lesiones causadas por los editores de bases se reparan de forma eficiente, pero que los riesgos genómicos y del desarrollo que persisten impiden, por ahora, su uso clínico reproductivo.
Resumen detallado
Las roturas de doble cadena de ADN inducidas por Cas9 se reparan mal en embriones humanos y pueden causar grandes deleciones y anomalías cromosómicas. En cambio, los editores de bases de adenina introducen cortes en una sola cadena y cambios de bases. Este estudio examinó los resultados de la reparación y el desarrollo temprano tras editar *PCSK9* y los promotores de *HBG1/2* en embriones humanos. En *PCSK9* se buscó una edición destinada a alterar su función; la edición de *HBG1/2* corresponde a una variante asociada con la expresión continuada de hemoglobina fetal en la edad adulta.
Los investigadores administraron ABE8.8-m como mRNA, y ABEmax y ABE8e(V106W) como complejos de proteína y ARN guía. Las inyecciones se realizaron en cigotos con dos pronúcleos o en ovocitos en metafase II en el momento de la fecundación. La edición se evaluó mediante secuenciación de Sanger, y también se usó secuenciación de nueva generación para el análisis de *HBG*.
La proteína ABEmax administrada en la fase de dos pronúcleos produjo ediciones homocigotas de *PCSK9* en 47 de 77 blastómeros (61 %); el mRNA de ABE8.8-m produjo ediciones homocigotas en 42 de 64 células (66 %). ABE8e(V106W) en forma de proteína, administrada en la fecundación, editó los 32 alelos diana examinados en células y pronúcleos de cinco embriones. El resumen también informa de la obtención de líneas de células madre editadas homocigotas.
El formato de administración afectó al desarrollo. De 44 embriones inyectados con mRNA de ABE8.8-m, 38 (86 %) se detuvieron en la fase de una a cuatro células y dos llegaron a blastocisto. Un editor inactivo mejoró significativamente el desarrollo en comparación con el editor activo (P=0,0081, prueba de Kruskal-Wallis). La detención del desarrollo también ocurrió sin ARN guía, lo que apunta a una actividad desaminasa independiente de la guía. Con los complejos de proteína y ARN guía de ABEmax o ABE8e(V106W), el desarrollo hasta blastocisto fue similar al de los controles y no se observó detención temprana en ninguna de las dos fases de inyección.
Tras la edición de bases no se observaron inserciones ni deleciones pequeñas o grandes. Sin embargo, se produjeron roturas cromosómicas en la diana y anomalías cromosómicas poco frecuentes, y la edición de espectador y fuera de diana fue en mosaico. Por tanto, la edición exitosa de la diana y el desarrollo hasta blastocisto no demostraron seguridad genómica.
Los autores concluyen que las lesiones inducidas por los editores de bases se reparan de forma eficiente en comparación con las roturas de ADN inducidas por Cas9, pero que los efectos adversos genómicos y del desarrollo impiden actualmente su uso clínico en reproducción. Estos son hallazgos en embriones de laboratorio, no evidencia de un embarazo seguro, de descendencia sana ni de prevención clínica de enfermedades.
Hallazgos clave
- ABE8e(V106W) protein delivered at fertilization edited all 32 PCSK9 target alleles examined in cells and pronuclei from 5 human embryos
- ABE8.8-m mRNA arrested 38 of 44 embryos (86%) at the one-to-four-cell stage; 2 reached blastocysts, and an inactive editor improved development (P=0.0081)
- No insertions or small or large deletions were observed after base editing, but rare on-target chromosome breakages and chromosomal abnormalities occurred
- ABEmax and ABE8e(V106W) protein–guide complexes supported blastocyst development similar to controls, with no early arrest observed at either injection stage
- The researchers derived homozygous edited stem cell lines, as reported in the abstract
- Bystander and off-target editing was mosaic, leaving genomic risks despite efficient intended editing
- Arrest also occurred when ABE8.8-m mRNA was delivered without guide RNA, implicating guide-independent deaminase activity
Metodología
Cigotos humanos con dos pronúcleos y ovocitos en metafase II, en el momento de la fecundación, recibieron editores de bases de adenina dirigidos a PCSK9 y/o HBG1/2. ABE8.8-m se administró como mRNA; ABEmax y ABE8e(V106W) se administraron como complejos de proteína y ARN guía. El texto proporcionado describe la secuenciación Sanger de blastómeros y pronúcleos, la secuenciación de nueva generación para el análisis de HBG, el seguimiento del desarrollo hasta el día seis, y controles con inyección simulada y con editor inactivo. La comparación entre mRNA activo e inactivo se realizó mediante una prueba de Kruskal-Wallis. El resumen también informa de la derivación de líneas de células madre editadas homocigóticas.
Limitaciones del estudio
El resultado de la edición completa de *PCSK9* se basó en 32 alelos examinados en cinco embriones, y no debe generalizarse a todos los embriones ni a todos los protocolos de edición. El desarrollo hasta la fase de blastocisto no establece la seguridad en etapas posteriores del desarrollo ni en la reproducción. Persistieron anomalías cromosómicas poco frecuentes, así como edición mosaica, edición espectadora (bystander) y edición fuera del objetivo. Los experimentos de detención del desarrollo asociados al mRNA implicaron actividad desaminasa independiente de la guía. El extracto proporcionado termina a mitad de una frase y no respalda los detalles adicionales de los ensayos, los resultados cuantitativos de edición fuera del objetivo ni las limitaciones de la comparación de métodos de administración incluidos en el resumen original.
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